Procédure et protocole d'extraction d'ARN des bactéries

L'extraction des acides nucléiques des bactéries notamment les ARN par le Trizol est une technique permettant d'isoler l'ARN de cellules ou de tissus.
L'extraction d'ARN à partir de n'importe quel système vivant est confrontée à un énorme défi en raison de la présence omniprésente d'enzymes ribonucléases dans les cellules, qui peuvent rapidement dégrader l'ARN. Ainsi, l'obtention d'un ARN de haute qualité est la condition préalable indispensable avant d'effectuer d'autres expériences de biologie moléculaire comme la réaction en chaîne quantitative en temps réel de la polymérase (qRTPCR). Pour générer les résultats les plus sensibles et les plus pertinents sur le plan biologique, la pratique de l'isolement d'ARN doit inclure certaines étapes importantes avant, pendant et après l'extraction réelle de l'ARN.

extraction arn total

Protcole d'extraction d'ARN bactérien

  1. Inoculer une seule colonie bactérienne dans 5 ml de milieu de bouillon LB et incuber les tubes à 37 ° C pendant 24 h sous agitation à 180 tr / min.
  2. Recueillir le culot cellulaire bactérien par centrifugation à 6000 tr / min pendant 5 min à température ambiante.
  3. Laver les culots cellulaires deux fois avec une solution saline de tampon phosphate autoclavé.
  4. Laver les culots avec du tampon TE autoclavé, centrifuger à 6000 tr / min pendant 5 min à température ambiante et recueillir le culot cellulaire.
  5. Remettre en suspension le culot cellulaire avec 1,5 ml de solution de trizol.
  6. Homogénéiser la solution par pipetage répété ou alternativement par vortex pendant 1 min.
  7. Alternativement, incuber les échantillons pendant 5 min à température ambiante ou à 60 ° C. Une incubation de 5 minutes à température ambiante entraînera la dissociation complète des complexes de nucléoprotéines.
  8. L'ARN est stable dans le trizol car il désactive les RNases. Par conséquent, à cette étape, vous pouvez faire une pause pendant une période plus courte ou stocker les échantillons en les congelant plus longtemps.
  9. Ajoutez 1/5 volume de chloroforme, secouez-le pour mélanger complètement pendant 15 s.
  10. Incuber la solution à température ambiante pendant 2 à 5 min.
  11. Centrifuger la solution à 12 000 tr / min pendant 10 min à 4 ° C. Si la centrifugation n'est pas appropriée, l'interphase contenant de l'ADN sera trouble et mal compactée.
  12. Transférer la couche aqueuse supérieure dans un nouveau tube neuf. Prenez soin de ne pas aspirer l'interface blanche contenant l'ADN. Cela peut entraîner une contamination de l'ADN dans la préparation d'ARN.
  13. Ajouter 1/2 volume initial d'éthanol glacé à 70%, éventuellement incuber pendant 10 min à température ambiante.
  14. Centrifuger à 10 000 tr / min pendant 15 min à 4 ° C, jeter le surnageant.
  15. Alternativement, utilisez RNeasy (de Qiagen) à la place de l'éthanol pour une meilleure précipitation pour une plus petite quantité d'ARN et également pour réduire le risque de contamination par des solvants organiques.
  16. Laver le culot cellulaire avec 500 µl d'éthanol à 70% préparé avec de l'eau exempte de RNase / eau traitée au diéthylpyrocarbonate (DEPC).
  17. Dissoudre le culot dans 50 à 100 µl d'eau exempte de RNase / eau traitée au DEPC, mélanger le culot par pipetage de haut en bas lentement.
  18. Conserver les tubes à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
extraction d'arn par trizol

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