Extraction d'ADN à partir de racines et des feuilles de plantes
Les progrès réalisés dans les technologies de séquençage ont rendu plus facile l'étude de l'écologie microbienne et de la dynamique des communautés. La première étape cruciale de ces analyses est la récupération efficace et représentative de l'ADN compétent en PCR à partir d'échantillons environnementaux complexes. Tous les protocoles d'extraction comportent des biais inhérents, ce qui signifie que le choix de la méthode implique un compromis entre divers facteurs, notamment l'efficacité, le rendement, l'universalité et l'extraction représentative. Ici, les détails sont donnés pour une méthode de routine utilisée dans notre laboratoire pour extraire l'ADN des sols, des sédiments, des biofilms, des racines et des champignons.
Protocole d'extraction d'ADN de racines et des feuilles de plantes
Les échantillons sont homogénéisés par battement des billes, précipitation sélective de protéines et de polysaccharides et ADN purifié par absorption sur du lait de verre.
- Coupez finement 200 mg de matériel végétal avec un scalpel stérile et ajoutez-les à un tube E de matrice de lyse.
- Ajouter 800 μl de tampon CLS-VF et 200 μl de solution de précipitation de protéines.
- Récupérer 700 µl du surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml.
- Ajouter 700 μl de matrice de liaison et bien mélanger avec le surnageant. Les tubes peuvent être placés sur un rotateur pendant 5 minutes pour augmenter l'efficacité de la liaison à l'ADN.
- Centrifuger à 14 000 × g pendant 5 min pour agglomérer les billes, les débris cellulaires, les polysaccharides et les protéines.
- Tournez les tubes par impulsion pour obtenir le lait de verre, qui contient maintenant l'ADN lié.
- Décanter le surnageant et remettre en suspension doucement le lait en verre dans 800 µl de tampon de lavage. Les tubes peuvent être placés sur un rotateur pendant 5 minutes pour augmenter l'efficacité du lavage.
- Pulser les tubes par centrifugation pour obtenir le lait de verre lavé et décanter le tampon de lavage utilisé. Si le tampon de lavage est marron ou coloré, l’étape 12 peut être répétée.
- Remettre les tubes dans la centrifugeuse et centrifuger pour collecter le surnageant restant au fond du tube.
- Retirer soigneusement le surnageant restant avec une micropipette.
- Sécher le culot à l'air pendant quelques minutes.
- Remettre en suspension le culot de lait de verre dans 200 μl de tampon TE. Assurez-vous que le culot est complètement remis en suspension et laissez le TE éluer l'ADN à température ambiante pendant 5 min. L'élution peut être améliorée par une incubation à 50 ° C dans un bain-marie ou un bloc chauffant.
- Centrifuger pendant 2 min à 14 000 × g.
- Récupérer 160 ul du surnageant, qui contient maintenant l'ADN de l'environnement.
- Transférer dans un tube étiqueté frais et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation.