Principe de PCR en temps réel RT-PCR | BioEduc

Qu'est ce qu'un ADNc ?

L'ADNc ou ADN complémentaire peut être défini comme la version de l' ADN double brin (ADNdb) d'une molécule d'ARNm. Dans la plupart des cas, l'ADNc est préparé à partir de l'ARNm par l'utilisation d'une enzyme spéciale appelée transcriptase inverse, qui a été isolée à l'origine du rétrovirus.

Principe de synthèse de ADNc ?

L'ADN complémentaire (ADNc) est l' ADN synthétisé à partir de l'ARN messager (ARNm). La réaction est catalysée par deux enzymes; transcriptase inverse ainsi que l'ADN polymérase. Conformément au dogme central de la vie, l'ADN est transcrit en ARNm, qui est ensuite traduit en protéines pour assurer les fonctions cellulaires. La principale différence entre l'ARNm procaryote et eucaryote est la présence ou l'absence de séquences d'introns parmi les exons. Au cours de la transcription de l'ARNm eucaryote, les séquences d'introns sont épissées, qui peuvent en outre être traduites en acides aminés pour effectuer leur fonction souhaitée. Comme les gènes procaryotes ne contiennent pas d'introns, leur ARN n'est pas soumis à la coupure et à l'épissage. Ainsi, l'ADN complémentaire est utilisé pour le clonage de gènes ou comme sondes génétiques ou dans la création de bibliothèques d'ADNc. L'application la plus large de l'ADNc est de surveiller le niveau d'expression de gènes fonctionnels spécifiques en utilisant la PCR quantitative en temps réel (qRT PCR) avec l'ADNc comme matrice.

Utilisations et applications des ADNc

La transcriptase inverse synthétise des matrices d' ADN simple brin à partir d'ARNm, qui peuvent ensuite être utilisées comme matrices pour la synthèse d'ADNdb. Il existe de nombreuses utilisations de l'ADNc dans les études de biologie moléculaire qui comprennent le clonage de gènes, les sondes génétiques, les banques d'ADNc ou l'expression de gènes. Des amorces spécifiques aux séquences peuvent être conçues pour l'hybridation dans les extrémités 5'-3' du fragment d'ADNc qui code pour une protéine. Après amplification, les deux extrémités du produit amplifié peuvent être coupées à l'aide de nucléases et peuvent être insérées dans les vecteurs d'expression. Comme les vecteurs d'expression peuvent facilement s'auto-répliquer dans la cellule hôte, les protéines seront traduites et le modèle d'expression du gène d'intérêt pourra être étudié.

Principe de Clonage d’ADN et rôle de ADNc

En ce qui concerne le clonage de gènes , l'ADN chromosomique et l'ADN plasmidique ont été utilisés comme matériel pour le clonage de gènes.

Un échantillon d'ARN peut également servir de point de départ pour le clonage d'ADN. L'enzyme transcriptase inverse peut utiliser l'ARN comme modèle pour fabriquer un brin complémentaire d'ADN. Cette enzyme est codée dans le génome des rétrovirus et fournit un moyen pour les rétrovirus de copier leur génome d'ARN dans des molécules d'ADN qui s'intègrent dans les chromosomes de la cellule hôte. De même, la transcriptase inverse est codée dans certains rétrotransposons et est nécessaire à la rétrotransposition de ces éléments.

Les chercheurs peuvent utiliser la transcriptase inverse purifiée dans une stratégie de clonage de gènes, en utilisant l'ARNm comme matière première ; l'autre brin d'ADN consiste à utiliser la RNaseH, qui digère partiellement l'ARN, générant de courts ARN qui sont utilisés comme amorces par l'ADN polymérase pour fabriquer un second brin d'ADN qui est complémentaire du brin fabriqué par la transcriptase inverse.

Enfin, l'ADN ligase scelle toute coupure dans ce second brin d'ADN. Lorsque l'ADN est fabriqué à partir d'ARN comme matière première, l'ADN est appelé ADN complémentaire (ADNc). Ce terme désignait à l'origine le brin unique d'ADN qui est complémentaire de la matrice d'ARN.

Pourquoi le clonage de l'ADNc est-il utile ?

Cependant, l'ADNc désigne désormais tout ADN, qu'il soit simple ou double brin, fabriqué à partir d'ARN . Pourquoi le clonage de l'ADNc est-il utile ? Du point de vue de la recherche, un avantage important de l'ADNc est qu'il manque d'introns, que l'on trouve souvent dans les gènes eucaryotes. Comme les introns peuvent être assez gros, il est beaucoup plus facile d'insérer des ADNc dans des vecteurs si les chercheurs veulent se concentrer sur la séquence codante d'un gène. Par exemple, si l'objectif principal est de déterminer la séquence codante d'un gène de structure, un chercheur insère l'ADNc dans un vecteur et détermine ensuite la séquence d'ADN de l'insert. De même, si un scientifique veut exprimer une protéine codée d'intérêt dans une cellule qui n'épisse pas correctement les introns (par exemple, dans une cellule bactérienne ), il est nécessaire de fabriquer des clones d'ADNc du gène correspondant.

Real-time PCR et PCR conventionnelle

La PCR en temps réel peut être utilisée pour quantifier la quantité d'un gène spécifique ou d'un ARNm spécifique dans un échantillon Dans certaines applications de la PCR, l'objectif est d'obtenir de grandes quantités d'une région de l'ADN. Pour déterminer si la PCR est réussie, un chercheur prélève généralement un échantillon d'ADN sur un gel, colore le gel avec du bromure d'éthidium (EtBr) qui se lie à l'ADN, puis observe le gel sous une lumière UV, ce qui rend l'EtBr fluorescent. Si une bande de la bonne taille est observée, l'expérience a toutes les chances d'être réussie. Cette approche PCR est parfois appelée "analyse des résultats", car la réussite de l'expérience est jugée après l'achèvement de la PCR.

Par comparaison, la technologie de la PCR en temps réel permet de quantifier des produits spécifiques de la PCR en "temps réel", car la PCR se déroule dans un thermocycleur. Comme les produits de la PCR sont en fin de compte dérivés de l'ADN matrice qui a été initialement ajouté à la réaction, cette approche permet aux chercheurs de déterminer la quantité d'ADN, comme l'ADN qui code un gène spécifique, qui se trouvait à l'origine dans l'échantillon avant la PCR. De même, si le matériel de départ est de l'ARNm qui est transcrit en ADN, la PCR en temps réel peut être utilisée pour déterminer combien d'ARNm d'un gène spécifique se trouvait dans un échantillon. Cela permet de pour mesurer quantitativement l'expression des gènes.