Principe de la PCR

La PCR ou (Polymerase Chain Reaction) ou la Réaction en chaine par polymérase est une technique de biologie moléculaire a pour but d'amplifier l'ADN (acide désoxyribonucléique). Le processus d'amplification d’ADN implique l'extraction d’ADN dans premier lieu et cette ADN doit être de bonne qualité une purification d’ADN est hautement recommandée. Le protocole de l'amplification d’ADN par PCR in vitro implique différentes étapes commençant par la dénaturation et puis l'hybridation et l'élongation.

Les étapes de la PCR

Quel sont les réactifs de PCR ?

Considérons maintenant les réactifs nécessaires pour une expérience de PCR. Les deux réactifs que nous avons déjà examinés à la figure 18.5a sont les amorces et un échantillon d'ADN contenant un gène d'intérêt, appelé matrice ADN. De plus, des désoxyribonucléosides triphosphates (dNTP) sont nécessaires, de même qu'une forme thermostable de l'ADN polymérase telle que la Taq polymérase, isolée de la bactérie Thermus aquaticus. Une forme thermostable de l'ADN polymérase est nécessaire car la PCR implique des étapes de chauffage qui inactivent la plupart des autres formes naturelles d'ADN polymérase (qui sont thermolabiles ou facilement dénaturées par la chaleur).

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Les étapes de la PCR

Dénaturation, hybridation de l'amorce et extension ou élongation de l'amorce. Pour faire des copies de l'ADN, l'ADN matrice est d'abord dénaturé par traitement thermique, provoquant la séparation des brins. Lorsque la température est abaissée, les amorces oligonucléotidiques se lient à l'ADN dans un processus appelé recuit. Une fois que les amorces ont été recuites, la température est légèrement élevée et la Taq polymérase catalyse la synthèse de brins d'ADN complémentaires dans la direction 5ʹ à 3ʹ, en commençant par les amorces. Ce processus, appelé extension de l'amorce, double la quantité d'ADN de la matrice. Les trois étapes représentées sur la figure 18.5b constituent un cycle d'une réaction de PCR. Le processus séquentiel de dénaturation - recuit d'amorce - extension d'amorce est ensuite répété pendant plusieurs cycles pour doubler la quantité d'ADN matrice plusieurs fois de suite.
Cette méthode est appelée une réaction en chaîne car les produits de chaque réaction précédente (les brins d'ADN nouvellement fabriqués) sont utilisés comme réactifs (les brins de matrice) dans les réactions ultérieures. La figure 18.6 suit une expérience de PCR sur quatre cycles. Comme la région d'intérêt est doublée à chaque cycle, le résultat final de quatre cycles correspond à 24 ou 16 copies de la région d'intérêt.

Appareillage

Étant donné que le matériau de départ contient de longs brins d'ADN chromosomique, certains des produits d'une expérience de PCR contiennent la région d'intérêt, ainsi que de l'ADN supplémentaire à chaque extrémité. Cependant, après de nombreux cycles, les produits ne contenant que la région d'intérêt prédominent fortement dans le mélange.
La PCR est effectuée dans un réacteur thermique, appelé thermocycleur, qui automatise la synchronisation de chaque cycle.
L'expérimentateur mélange l'échantillon d'ADN, les dNTP, la Taq polymérase et un excès d'amorces ensemble dans un seul tube. Le tube est placé dans un thermocycleur et l'expérimentateur configure la machine pour qu'elle fonctionne dans une plage de températures et un nombre de cycles définis.
Au cours de chaque cycle, le thermocycleur augmente la température pour dénaturer les brins d'ADN, puis abaisse la température pour permettre le recuit et l'extension. Typiquement, chaque cycle dure 2 à 3 minutes et est ensuite répété. Une analyse PCR typique impliquera probablement 20 à 30 cycles de réplication.

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