Purification et Contrôle de la qualité de l'ADN

Le rendement et la pureté de l'ADN peuvent être testés qualitativement par électrophorèse sur agarose et par PCR visant des gènes cibles universels.

Extraction d'ADN à partir de racines et de feuilles de plantes
  1. Chargez une partie aliquote (10 µl) de l'ADN préparé sur un gel d'agarose à 1% p / v et soumettez-la à une électrophorèse. Colorer et photographier le gel selon les procédures standard.
  2. Examiner le poids moléculaire de l’ADN extrait par rapport à un marqueur de poids moléculaire ou à une échelle d’ADN. L'ADN extrait devrait être supérieur à 10 kb et devrait être visible sous forme d'une bande cohérente sans s'étaler dans les régions de faible poids moléculaire. Aucun extrait d'ARN ne devrait être présent dans l'extraction, mais si c'est le cas, la digestion de la RNase A peut être effectuée simultanément à la PCR en ajoutant 1 µl d'une solution d'ARNase A pré-bouillie à 1 mg / ml à chaque réaction.
  3. Estimer la quantité d’ADN présente par comparaison aux quantités connues présentes dans l’échelle de poids moléculaire. Il est souvent impossible d'obtenir des lectures spectrophotométriques précises à partir de l'ADN environnemental en raison de substances interférentes.
  4. Utilisez 1 μl de l’ADN et 1 μl d’une dilution 1:10 dans TE comme matrices pour la PCR. La PCR de test doit être dirigée sur une cible d'ADN à nombre de copies élevé dont on sait qu'elle est présente dans l'échantillon environnemental d'origine. Les gènes de l'ARN ribosomal 16S constituent une cible appropriée pour l'ADN bactérien et tout ensemble d'amorces universelles pour l'ADNr 16S peut être utilisé dans ce test. Pour les cibles eucaryotes, la région d'espacement interne transcrit (ITS) des gènes de l'ARN ribosomal est également une bonne cible pour les amorces universelles.
  5. Exécuter la PCR sur un gel d'agarose à 2% (p / v) selon les méthodes standard. La plupart des extractions généreront des amplicons à partir d’ADN pur et dilué; cependant, si des inhibiteurs de PCR sont présents, les amplicons ne peuvent être générés qu'à partir de la dilution 1:10. Si aucune amplification n'est générée malgré la présence d'ADN visible, un lavage supplémentaire de la matrice de liaison (étape 12) peut être justifié. Sinon, une dilution supplémentaire ou un nettoyage de l'ADN en utilisant de l'éthanol précipité peut être nécessaire. Il est rare que des ADN préparés à l'aide de la technique de la sous-position 3.1 ne soient pas compétents en PCR.