Réactifs requis pour l'extraction de plasmide par lyse alcaline
L'extraction de (généralities sur les plasmides) plasmide (Voir le protocol d'extraction) par lyse alcaline nécessite un ensemble de reactifs et tampons d'extraction et de purification des acides nucléiques citons, un milieu de culture pour la préparation de susupension bacterienne comme Bouillon Luria – Bertani, et autre tampons et reactifs, Tris EDTA Buffer, Glucose, Acide éthylènedinitrilo tétraacétique ou EDTA, Hydroxyde de sodium NaOH, Acétate De Potassium et acide acétique glacial.
Rôle de Bouillon Luria – Bertani
C'est un milieu riche qui permet une croissance rapide ainsi que de bons rendements de croissance de nombreuses espèces de bactéries. C'est le milieu de croissance le plus couramment utilisé pour la culture de cellules E. coli lors d'études en biologie moléculaire. Le bouillon LB peut aider E. coli à obtenir une OD600 2–3 dans des conditions d'incubation normales.
Rôle de Tris EDTA Buffer (TE)
Le tampon TE est préparé en mélangeant du Tris 50 mM et de l'EDTA 50 mM dans de l'eau et en maintenant le pH 8,0. Le constituant principal du tampon TE est le Tris, qui agit comme un tampon de pH commun pour contrôler le pH lors de l'ajout d'autres réactifs. L'EDTA chélate des cations comme le Mg2+. Par conséquent, le tampon TE est utile pour solubiliser l'ADN en le protégeant de la dégradation.
Rôle de Glucose
Pendant l'isolement de l'ADN plasmidique, du glucose est ajouté dans le tampon de lyse pour augmenter la pression osmotique à l'extérieur des cellules. Le glucose maintient l'osmolarité et empêche le tampon d'éclater les cellules. De plus, le glucose est utilisé pour rendre la solution isotonique.
Rôle de Acide éthylènedinitrilo tétraacétique EDTA
L'EDTA se lie aux cations divalents de la paroi cellulaire, affaiblissant ainsi l'enveloppe cellulaire. Après la lyse cellulaire, l'EDTA limite la dégradation de l'ADN en liant les ions Mg2+, cofacteurs nécessaires des nucléases bactériennes. De cette manière, il inhibe les nucléases conduisant à la rupture de la paroi cellulaire et de la membrane cellulaire.
Rôle de Hydroxyde de sodium NaOH
L’hydroxyde de sodium est utilisé pour séparer l’ADN chromosomique bactérien de l’ADN plasmidique. L'ADN chromosomique et l'ADN cisaillé sont tous deux linéaires, alors que la plupart de l'ADN plasmidique est circulaire. Lorsque le milieu de solution devient basique en raison de l'ajout d'hydroxyde de sodium, les molécules d'ADNdb sont séparées par dénaturation et leurs bases complémentaires ne sont plus associées les unes aux autres. D'autre part, bien que l'ADN plasmidique soit dénaturé, il n'est pas séparé. Les brins circulaires peuvent facilement trouver leurs brins complémentaires et se renaturer en molécule d'ADNdb plasmidique circulaire une fois que la solution alcaline est neutralisée. Cette propriété unique de l'ADN plasmidique est exploitée pour séparer l'ADN plasmidique de l'ADN chromosomique en ajoutant du NaOH.
Rôle de Acétate De Potassium
L’acétate de potassium est utilisé pour précipiter sélectivement l’ADN chromosomique et d’autres débris cellulaires hors de l’ADN plasmidique souhaité. L'acétate de potassium joue trois rôles lors de l'isolement de l'ADN plasmidique :
- il permet à l'ADN circulaire de se renaturer tandis que l'ADN cellulaire cisaillé reste dénaturé en tant qu'ADNsb
- il permet la précipitation de l'ADNsb car les grands ADNsb sont insolubles en forte concentration en sels
- lorsque de l'acétate de potassium est ajouté au SDS, il forme du KDS, qui est insoluble. Cela permet d’éliminer facilement la contamination par le SDS de l’ADN plasmidique extrait.
Rôle de Acide acétique glacial
Il neutralise les conditions alcalines dans la solution qui ont été développées par addition de NaOH à la solution, ce qui contribue à la renaturation rapide de l'ADN plasmidique. Bien qu'il n'y ait pas beaucoup de différence entre l'acide acétique et l'acide acétique glacial, l'acide acétique glacial est l'acide acétique anhydre. L'acide acétique glacial ne contient pas d'eau, alors que l'acide acétique est un acide faible qui peut être concentré. L'acide acétique glacial est un acide acétique de grande pureté supérieur à 99,75%.
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