Extraction et Isolement des plasmides

Le plasmide est généralement un morceau circulaire ou parfois linéaire d’ADNdb présent dans les bactéries. Dans de nombreux cas, il porte des gènes non essentiels, qui sont responsables de la survie d'une bactérie particulière dans des conditions défavorables.

L’extraction d’ADN implique une lyse cellulaire, la lyse cellulaire est un processus de destruction d'une cellule en provoquant l’éclatement de la membrane plasmique, Il existe différentes méthodes de préparation des lysats cellulaires telles que lyse cellulaire par ébullition ou boiling, lyse cellulaire par sonication, lyse cellulaire par homogénéisation, la lyse enzymatique, lyse cellulaire par congélation, lyse cellulaire par broyage, lyse cellulaire par choc thermique etc. Les principes et procédures de toutes les pratiques disponibles ont été fournis ci-dessous.

Principle of isolation of plasmid DNA from bacteria

Protocole d'extraction d'ADN plasmidique par lyse alcaline

  1. Préparez les solutions suivantes avec les compositions suivantes avant d'isoler l'ADN plasmidique de bactéries.
    • Solution I (tampon de lyse I): Tris 50 mM pH 8,0 avec HCl, EDTA 10 mM. Pour 1 l, dissolvez 6,06 g de base Tris, 3,72 g d'EDTA.2H2O dans 800 ml d'eau milli Q, ajustez le pH à 8,0 avec HCl, compléter le volume à 1 l avec de l'eau milli-Q, autoclaver et conserver à 4 ° C.
    • Solution II (tampon de lyse II): NaOH 200 mM, 1% de SDS. Pour 1 litre, dissolvez 8,0 g de NaOH dans 950 ml d'eau milli-Q et 50 ml d'une solution de SDS à 20%. La solution II doit être fraîchement préparée juste avant l’utilisation.
    • Solution III (tampon de lyse III): KOAc 3,0 M, pH 5,5. Pour 1 litre, dissolvez 294,5 g d’acétate de potassium dans 500 ml d’eau milli-Q, ajustez le pH à 5,5 avec de l’acide acétique glacial (~ 110 ml) et monter le volume final à 1 litre avec addition d'eau milli-Q, autoclaver et conserver à 4 ° C.
  2. Inoculer une seule colonie bactérienne dans 5 ml de milieu de bouillon LB et incuber le tube à 37 ° C pendant 24 h avec une agitation par rotation à 180 tr / min.
  3. Recueillir le culot de cellules bactériennes provenant de la culture développée par centrifugation à 6000 tr / min pendant 5 min à température ambiante.
  4. Jeter le surnageant et remettre en suspension les pastilles de cellules avec 600 µl de tampon TE autoclavé, centrifuger à nouveau à 6000 tr / min pendant 5 min à température ambiante et recueillir la cellule.
  5. Remettre en suspension le culot cellulaire avec 1 ml de solution glacée I. Pipeter de haut en bas pour remettre complètement en suspension le culot cellulaire.
  6. Ajouter 200 µl de Solution II à la suspension. Bien mélanger par inversion douce répétée. Évitez de vortexer.
  7. Ajoutez 1,5 ml de solution III glacée au lysat cellulaire. Ne pas vortexer.
  8. Recherchez l'apparition d'un précipité blanc.
  9. Centrifuger à 12 000 tr / min pendant 30 min à 4 ° C.
  10. Transférer le surnageant dans un nouveau tube.
  11. Ajouter 2,5 volumes d'isopropanol pour précipiter l'ADN plasmidique. Bien mélanger par inversion répétée sans vortex.
  12. Centrifuger à 12 000 tr / min pendant 30 min à 4 ° C.
  13. Jeter le surnageant pour recueillir le culot.
  14. Rincer le culot avec de l'éthanol à 70% glacé, puis sécher à l'air pendant environ 10 minutes pour évaporer l'éthanol.
  15. Ajouter 50 µl de tampon TE pour dissoudre le culot.
  16. Ajouter 2 µl de RNase (10 mg / ml) et incuber pendant 20 min à température ambiante pour éliminer la contamination par l'ARN.
  17. Conservez le tube à -20 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.

Observations sur l'extraction d'ADN plasmidique par lyse alcaline

Passez l’ADN plasmidique isolé sur un gel d’agarose à 0,8% et observez le schéma de formation de bandes qui sera visible dans l’ordre suivant en fonction de leur vitesse de migration, c’est-à-dire super-enroulé > linéaire > cercles nickés > dimère > minuterie > autres. De plus, mesurez la DO à 260 et 280 pour vérifier la quantité et la qualité du plasmide isolé.