Qu'est-ce qu'un plasmide
Le plasmide est généralement un morceau circulaire ou parfois linéaire d’ADNdb présent dans les bactéries. Dans de nombreux cas, il porte des gènes non essentiels, qui sont responsables de la survie d'une bactérie particulière dans des conditions défavorables.
Généralités sur les plasmides
En raison de leur petite taille et de leur polyvalence, les plasmides bactériens sont devenus un élément central de la recherche en biotechnologie dans de nombreuses expériences allant de l'expression des gènes humains dans des cellules bactériennes au séquençage de l'ADN.
Le terme «plasmide» a été introduit par le biologiste moléculaire américain Joshua Lederberg en 1952. Dans une seule cellule bactérienne, le nombre de plasmides identiques varie de 1 à 1000 dans différentes circonstances et varie entre 1 et plus de 1000 kb. Les scientifiques ont profité des plasmides pour les utiliser comme outils de clonage, de transfert et de manipulation de gènes.
Les plasmides utilisés en génie génétique sont appelés vecteurs, qui sont couramment utilisés pour multiplier ou exprimer un gène particulier.
Les plasmides peuvent être introduits dans les cellules bactériennes par transformation. En se divisant rapidement, les bactéries peuvent être utilisées comme usines pour générer des fragments d'ADN en grand nombre.
Il existe de nombreuses façons de classer les plasmides bactériens. D'après leurs fonctions, ils sont:
- les plasmides R de résistance
- les plasmides F de fertilité
- les plasmides de col
- les plasmides de dégradation
- les plasmides de virulence.
Les plasmides peuvent appartenir à un ou plusieurs de ces groupes fonctionnels. L'ADN plasmidique apparaît généralement dans l'une des cinq confirmations, c'est-à-dire un ADN dénommé circulaire ouvert, circulaire détendu, linéaire, super enroulé ou fermé de manière covalente et dénaturée comme un ADN super enroulé.
Les plasmides sont des molécules d'ADN distinctes du chromosome de la cellule bactérienne et capables de transmettre de manière stable sans se lier au chromosome bactérien. Il peut être transféré horizontalement entre les cellules et est responsable du transport et de la propagation des gènes de résistance aux antibiotiques parmi les souches environnementales et cliniques. En outre, les plasmides portent également de nombreux gènes qui codent pour une large gamme d’activités métaboliques, permettant ainsi à la bactérie hôte de dégrader les polluants, à la production de composés antibactériens, démontrant la virulence et le pouvoir pathogène des bactéries.
Principe d'extraction des plasmides
Les plasmides (Voir protocol d'extraction) doivent être isolés des bactéries pour purifier une séquence spécifique à utiliser comme vecteurs dans le clonage moléculaire.
Il existe divers procédés et kits commerciaux disponibles aujourd'hui pour l'isolation de la conformation pure et souhaitée de l'ADN plasmidique, quel que soit le nombre de copies, élevé ou faible.
La plupart des procédures d'isolement de plasmides disponibles reposent sur le fait que les plasmides se présentent généralement sous une configuration circulaire fermée de manière covalente chez les bactéries. Ainsi, après la lyse cellulaire, la plus grande partie du contenu intracellulaire sort de la cellule et ensuite, le plasmide est enrichi et purifié. Étant donné que l'ADN plasmidique est très sensible aux contraintes mécaniques, il convient d'éviter les forces de cisaillement, telles que le mélange vigoureux ou le vortexage, après la lyse cellulaire. Dans ce contexte, toutes les étapes de mélange doivent être effectuées par une inversion minutieuse des tubes à plusieurs reprises plutôt que par vortexage. Les extrémités peuvent être coupées pour minimiser la force de cisaillement.
Le stade le plus délicat de l'isolement des plasmides est la lyse des bactéries, car une lyse incomplète et une dissolution totale de la cellule peuvent réduire le rendement en ADN plasmidique.
Comme la simple lyse de la cellule génère une énorme quantité d’ADN génomique à partir de bactéries de poids moléculaire élevé, elles peuvent être séparées de l’ADN plasmidique par centrifugation à grande vitesse et d’autres débris cellulaires.
La méthode la plus populaire d'isolement de l'ADN plasmidique est l'utilisation de Birnboim et Doly (1979). Cette technique tire parti de la plage étroite de différence de pH (12,0 à 12,5), qui dénature l’ADN linéaire mais non l’ADN circulaire fermé de manière covalente. Ainsi, lors de la digestion par le lysozyme, la paroi cellulaire de bactéries s’affaiblit et les macromolécules cellulaires sortent de la cellule en raison du traitement au SDS et à l’hydroxyde de sodium.
L'ADN chromosomique reste sous forme de poids moléculaire élevé mais devient dénaturé. Lorsqu'il est neutralisé avec un milieu acide, l'ADN chromosomique se renature et s'agrège pour former un réseau insoluble. En outre, une concentration élevée d'acétate de sodium précipite les complexes protéine-SDS et l'ARN de haut poids moléculaire.
Comme le pH de la dénaturation alcaline est soigneusement contrôlé, la forme circulaire fermée des molécules d’ADN plasmidique reste toujours dans leur forme native dans la solution, tandis que les autres macromolécules contaminants coprécipitent. Ainsi, le précipité peut être éliminé par centrifugation pour concentrer le plasmide par précipitation à l'éthanol. Si nécessaire, les plasmides peuvent être encore purifiés par filtration sur gel.
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