Protocole d'extraction d'ADN génomique | BioEuc

Extraction de l'adn génomique bactérien

Les bactéries possèdent une architecture génomique compacte, distincte des eucaryotes. Il montre une forte corrélation entre la taille du génome et le nombre de gènes fonctionnels, et les gènes sont structurés en opérons reflétant les transcripts polycistroniques. Parmi les différentes espèces de bactéries, la taille du génome varie quelque peu, mais elle est inférieure à celle de nombreux eucaryotes. Dans cet article on focalise sur le principe d'extraction d'adn génomique bacterien et la technique et les méthodes impliquées lors de l'extraction de l'adn et notamment le protocole et la procédure détaillée d'extraction de l'adn et les réactifs utilisés dans la technique.

L'ADN a été isolé pour la première fois en 1869 par Friedrich Miescher, qu'il a appelé nucléine, à partir de leucocytes humains. Comme les bactéries ont une taille beaucoup plus petite que celle des cellules eucaryotes, leur contenu en génome est plus petit. La majeure partie du génome bactérien se compose d'une seule molécule d'ADN et la bactérie réplique son ADN dans des conditions favorables de nutrition, de pH et de température. Le processus de division des cellules bactériennes est beaucoup plus simple que celui des cellules eucaryotes et, par conséquent, les bactéries sont capables de se développer et de se diviser beaucoup plus rapidement.

L'isolement et la purification de l'ADN à partir de cellules constituent l'une des conditions préalables les plus courantes de la biologie moléculaire contemporaine, reflétant le passage de la biologie cellulaire à la biologie moléculaire, d'in vivo à in vitro.

Principe d'extraction d'ADN génomique

De nombreuses techniques différentes sont disponibles pour isoler l'ADN génomique à partir de cellules bactériennes; Cependant, ils suivent tous les étapes habituelles de la rupture cellulaire, de l’élimination des protéines, suivie de la libération du matériel génétique. L'objectif principal de cette expérience est de fournir un ADN de haute qualité pouvant être stocké pendant plusieurs années dans des conditions appropriées. Les étapes courantes impliquant l'isolement de l'ADN comprennent la lyse de cellules, suivie de l'élimination des protéines, des glucides, de l'ARN, etc. Les perturbations des parois cellulaires et des membranes sont généralement réalisées avec une combinaison appropriée d'enzymes pour digérer la paroi cellulaire (généralement le lysozyme) et de détergents pour rompre les membranes. Le détergent ionique le plus couramment utilisé à cette étape est le dodécyl sulfate de sodium (SDS). L'ARN est généralement dégradé par l'addition de RNase exempte de DNase. Les oligoribonucléotides résultants sont séparés de l'ADN de haut poids moléculaire sur la base de leur plus grande solubilité dans les solvants non polaires (généralement alcool / eau). Les protéines sont soumises à une dénaturation chimique et / ou à une dégradation enzymatique par addition de protéinase-K. La technique d'élimination des protéines la plus courante implique la dénaturation et l'extraction dans la phase organique, à savoir. phénol et chloroforme.

Réactifs requis et leur rôle

Bouillon Luria – Bertani

Le bouillon Luria – Bertani (LB) est un milieu riche qui permet une croissance rapide et de meilleurs rendements pour de nombreuses espèces, dont Escherichia coli. Facile à préparer, la croissance rapide de la plupart des souches d'E. Coli, des compositions faciles à obtenir et simples contribuent à la popularité du bouillon LB. E. coli atteint une densité optique (DO) 600 2–3 dans un bouillon LB dans des conditions d’incubation normales sous agitation à 24 h.

Role de Tris EDTA Buffer/Tampon dans l'extraction d'adn

Il peut être préparé en mélangeant de l'eau Tris à 50 mM et de l'acide éthylène-dinitrile tétra-acétique (EDTA) à 50 mM et en maintenant le pH à 8,0. En tant que constituant majeur du tampon Tris EDTA (TE), Tris agit comme un tampon pH commun pour contrôler le pH, tandis que l'EDTA chélate des cations comme le Mg2+ .Ainsi, le tampon TE est utile pour solubiliser l'ADN et le protéger de la dégradation.

Role de SDS Sulfate de Dodécyl Sodium dans l'extraction d'adn

Le dodécyl sulfate de sodium à 10% (SDS) est utilisé pour l'isolement de l'ADN génomique. Le SDS est un détergent fortement anionique capable de solubiliser les protéines et les lipides membranaires. Cela aidera les membranes cellulaires à se décomposer et à exposer les chromosomes à la libération d'ADN.

Role de Proteinase-K l'extraction d'adn

La protéinase-K à 20 mg/ml est une très bonne enzyme qui dégrade la plupart des types d’impuretés protéiques pour obtenir un produit d’ADN de qualité. Il est également responsable de l'inactivation des nucléases, empêchant ainsi les dommages de l'ADN isolé.

Role de NaCl Solution l'extraction d'adn

NaCl 5 M fournit des ions Na+ qui bloquent la charge négative des phosphates de l'ADN. Le phosphate chargé négativement dans l'ADN provoque la repousse des molécules. Les ions Na+ forment une liaison ionique avec les phosphates chargés négativement; neutralisez ainsi les charges négatives et laissez les molécules d’ADN se réunir.

Role de CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide l'extraction d'adn

Le bromure de cétyl-triméthylammonium (CTAB) est un détergent qui aide à lyser la membrane cellulaire. En dehors de cela, la solution de CTAB-NaCl se lie aux protéines contenues dans le lysat cellulaire digéré et contribue à la séparation de l'ADN des protéines produisant un anneau intermédiaire de protéines. En tant que détergent cationique, le CTAB est facilement soluble dans l'eau ainsi que dans l'alcool et peut former des complexes avec le polysaccharide et les protéines résiduelles.

Role de Phénol: chloroforme: alcool isoamylique l'extraction d'adn

C'est une méthode d'extraction liquide – liquide. Il sépare des mélanges de molécules basés sur la solubilité différentielle des molécules individuelles dans deux liquides non miscibles différents. Le chloroforme mélangé avec du phénol est plus efficace pour dénaturer les protéines que le seul réactif. L'alcool isoamylique de chloroforme est un type de détergent qui se lie aux protéines et aux lipides de la membrane cellulaire et les dissout. De cette manière, les liaisons qui retiennent les membranes cellulaires sont rompues. Après dissolution de la membrane cellulaire, l’alcool isoamylique de chloroforme forme des amas de complexes protéines-lipides; ainsi, un précipité est formé. Le principe de cette précipitation est que le complexe lipide-protéine est un composé non aqueux et que l’ADN est un composé aqueux. Ainsi, la phase aqueuse supérieure contient de l'acide nucléique, la phase intermédiaire contient des lipides et la phase organique inférieure contient des protéines.

Role de Isopropanol l'extraction d'adn

L'ADN est hautement insoluble dans l'isopropanol et par conséquent, l'isopropanol se dissout dans l'eau pour former une solution qui provoque l'agrégation et la précipitation de l'ADN dans la solution. L'isopropanol est utilisé comme une meilleure alternative à l'éthanol en raison de son potentiel plus élevé de précipitation de l'ADN à des concentrations plus faibles. En outre, l'évaporation prend moins de temps.

Procédure et protocole d'extraction d'adn

1. Cultivez une culture bactérienne de 5 ml jusqu'à saturation. Centrifugez (6000 tours/minute pendant 10 min) 1,5 ml de culture pendant 2 min ou jusqu'à formation d'un culot compact.
2. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 567 µl de tampon TE.
3. Ajouter 30 µl de SDS à 10% et 3 µl de 20 mg/ml de protéinase-K, bien mélanger et incuber pendant 1 h à 37 ° C.
4. Ajouter 100 µl de NaCl 5 M et bien mélanger. Si la concentration de NaCl est < 0,5 M , le l'acide nucléique peut aussi précipiter.
5. Ajouter 80 µl de solution de NaCl et bien mélanger.
6. Ajouter 1 volume (0,7–0,8 ml) de mélange chloroforme/alcool isoamylique 24:1, bien mélanger et centrifuger à 6000 tr/min pendant 4 à 5 min. Transférer le surnageant dans un nouveau tube.
7. Au surnageant, ajoutez 1 volume de 25: 24: 1 phénol/chloroforme/alcool isoamylique, extraire à fond et centrifuger à 6000 tr / min pendant 5 min. Transférer le surnageant dans un tube frais.
8. Au surnageant, ajoutez 0,6 volume d’isopropanol et mélangez doucement jusqu’à obtention précipité d'ADN blanc. Centrifuger à 10 000 tr / min pendant 10 min brièvement dans la Température ambiante, éliminer le surnageant et ajouter 100 µl d'éthanol à 70% pour obtenir un culot.
9. Centrifuger ce mélange pendant 5 min à la température ambiante, et sécher le culot par évaporation complète de l'éthanol.
10. Remettre en suspension ce culot sec dans 50 µl de tampon TE pour obtenir un ADN. Le rendement typique est de 5 à 20 µg ADN/ml de culture de départ (10⁸-10⁹ cellules/ml).
11. Vérifier la pureté de l'ADN avec du gel d'agarose électrophorèse et nano-drop et stocker à 4 ° C dans le tampon TE jusqu'à utilisation ultérieure.