Procédures et protocoles de la lyse cellulaire

L’extraction d’ADN implique une lyse cellulaire, la lyse cellulaire est un processus de destruction d'une cellule en provoquant l’éclatement de la membrane plasmique, Il existe différentes méthodes de préparation des lysats cellulaires telles que lyse cellulaire par ébullition ou boiling, lyse cellulaire par sonication, lyse cellulaire par homogénéisation, la lyse enzymatique, lyse cellulaire par congélation, lyse cellulaire par broyage, lyse cellulaire par choc thermique etc. Les principes et procédures de toutes les pratiques disponibles ont été fournis ci-dessous.

lyse cellulaire ultason sonication

Lyse cellulaire par ébulition (Boiling)

  1. Cultiver E.coli jusqu'à 0,5 McFarland suspension dans du milieu LB. Si nécessaire, diluez la culture cultivée pour obtenir des suspensions de 0,5 McFarland, une concentration particulière.
  2. Centrifuger à 6000 tr / min pendant 5 min à température ambiante.
  3. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 200 µl d'eau milli-autoclave autoclavée.
  4. Réglez le bain-marie à 100 ° C ou faites bouillir de l'eau dans un récipient.
  5. Gardez les tubes à centrifuger contenant la culture bactérienne dans de l'eau bouillante pendant 10 min.
  6. Enclenchez immédiatement les tubes à centrifuger dans de la glace pendant 5 min.
  7. Après incubation sur de la glace, centrifuger le tube à 10 000 tr/min pendant 5 min à 4 ° C.
  8. Transférer le surnageant dans un nouveau tube et conservez-le à 4 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.

Lyse cellulaire par Ultrason Sonication

  1. Inoculer 4 à 5 cultures bactériennes fraîches dans 2 ml de bouillon LB préalablement autoclavé et incuber à 37 ° C et à 180 rpm pendant une nuit.
  2. Transférer 1 ml de la suspension bactérienne dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 ml et centrifuger à 6000 tr / min pendant 5 min à 4 ° C.
  3. Jeter le surnageant et ajouter le reste de la culture au culot dans un tube à centrifuger et centrifuger à nouveau à 6000 tr / min pendant 5 min à 4 ° C.
  4. Jeter le surnageant et ajouter 600 µl d'eau stérile milli-Q et bien mélanger par vortex.
  5. Centrifuger à 6000 tr / min pendant 5 min à température ambiante et jeter le surnageant, ajouter 600 µl de tampon 1 X TE et mélanger à nouveau par vortexage.
  6. Soniquer pendant 2 min à une amplitude de 22 µm avec des impulsions brèves (5 à 10 s) et des pauses (10 à 30 s).
  7. Centrifuger à 10 000 tr / min pendant 5 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger.
  8. Stockez le surnageant à -20 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.

Lyse cellulaire par "lysozyme digestion"

  1. Cultiver E. coli jusqu'à 0,5 McFarland suspension dans du milieu LB. Si possible, diluez la culture cultivée pour obtenir des suspensions de 0,5 McFarland.
  2. Dissolvez le lysozyme dans une quantité appropriée de tampon TE pour obtenir une solution à 10 mg / ml. Ajouter la poudre d’enzyme dans le tampon et le dissoudre lentement et conserver sur de la glace. Ne pas secouer ou mélanger.
  3. Ajouter 100 µl de solution mère de lysozyme (10 mg / ml) à 1 ml de culture bactérienne dans du tampon TE pour obtenir une concentration finale de 1 mg / ml.
  4. Incuber la solution à 30 ° C et agiter doucement pendant 30 min à 1 h.
  5. Centrifuger la solution à 10 000 tr / min pendant 10 min à 4 ° C et transférer le surnageant dans un nouveau flacon.
  6. Conservez le surnageant à - 20 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.

Lyse cellulaire par congélation et décongélation répétées

  1. Inoculer 4 à 5 cultures bactériennes fraîches dans 2 ml de bouillon LB préalablement autoclavé et incuber à 37 ° C et à 180 tours par minute pendant une nuit.
  2. Transférer 1 ml de la suspension bactérienne dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 ml et centrifuger à 6000 tr / min pendant 5 min à 4 ° C.
  3. Jeter le surnageant et ajouter le reste de la culture au culot dans un tube à centrifuger et centrifuger à nouveau à 6000 tr / min pendant 5 min à 4 ° C.
  4. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 200 µl de milli-Q stérilisé.
  5. Congeler le culot cellulaire assez lentement dans de l'azote liquide pendant 3 min.
  6. Placer le tube dans un bain d'eau chaude (réglé auparavant entre 80 et 90 ° C) pendant 3 min.
  7. Répétez le cycle gel-dégel trois fois. Assurez-vous de mélanger votre tube entre chaque cycle.
  8. Centrifuger les tubes à 10 000 tr / min pendant 5 min à 4 ° C.
  9. À l'aide d'une micropipette, transférer le surnageant, qui contient l'ADN, dans un nouveau tube et jeter le culot.
  10. Conservez les tubes à -20 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.

Lyse cellulaire par Homogénéisation

  1. Inoculer 4 à 5 colonies bactériennes isolées dans 2 ml de bouillon LB préalablement autoclavé et incuber à 37 ° C à 180 tr / min pendant une nuit.
  2. Transférer 1 ml de la suspension bactérienne dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 ml et centrifuger à 6000 tr / min pendant 5 min à 4 ° C.
  3. Jeter le surnageant et ajouter le reste de la culture au culot dans le tube à centrifuger. Centrifuger à nouveau à 6000 tr / min pendant 5 min à 4 ° C.
  4. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 200 µl de tampon TE stérilisé.
  5. Basculez les vannes à trois voies pour alimenter le matériau provenant du réservoir contenant la cellule microbienne. Réglez la décharge dans l'autre réservoir.
  6. Connectez l'alimentation en eau de refroidissement à l'homogénéisateur et assurez-vous qu'il est allumé.
  7. Connectez et mettez sous tension les autres utilitaires nécessaires à l'utilisation de l'homogénéisateur.
  8. Réglez la pression de fonctionnement à zéro et démarrez l'homogénéisateur. Observez l'augmentation de pression sur la jauge de l'instrument pour vous assurer que le circuit de circulation est disponible.
  9. Réglez la pression de service à la valeur souhaitée avec précaution.
  10. Lorsque le débit d'alimentation est faible, relâchez la pression et mettez le système hors tension.
  11. Laisser refroidir l'homogénat en incubant immédiatement les échantillons sur de la glace pendant 5 min.
  12. Centrifuger l'homogénat à 10 000 tr / min pendant 10 min à 4 ° C et transférer le surnageant dans un nouveau flacon.
  13. Conservez les flacons à -20 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.

Observations

Le lysat simple est l'extrait brut d'acide nucléique de la cellule bactérienne. L'analyse spectrophotométrique du lysat bactérien donne une idée claire de la quantité d'ADN présent dans celui-ci ainsi que de sa qualité.

Cet extrait brut peut être utilisé ultérieurement pour des applications telles que l'amplification de l'ADN par réaction en chaîne de la polymérase (PCR), la digestion par restriction où il y a moins de risque d'interférence par les impuretés d'ARN et de protéines.

L'absorbance à 260 nm est utilisée pour quantifier les teneurs en acide nucléique. Une valeur d'absorbance à 260 nm dans 1 ml produit une DO de 1. Ainsi, en appliquant le même facteur de conversion:

  1. 1 unité A260 ADNdb = 50 µg
  2. 1 unité A260 ADNss = 33 µg
  3. 1 unité A260 ARNss = 40 µg

Problèmes et solutions

Problème: ADN dégradé.

Cause possible : Une température plus élevée pendant l'ébullition ou la sonication peut dégrader l'ADN.

Solution possible:

  1. Après 10 minutes de lyse bouillante, étendre immédiatement sur de la glace pendant 5 minutes, de sorte qu'une grande partie de l'ADN dénaturé puisse être renaturée pour faciliter la dénaturation.
  2. La sonication génère beaucoup de chaleur. Par conséquent, la sonication peut être effectuée à des impulsions courtes avec des pauses.

Problème: Pas de rendement.

Cause possible: La lyse cellulaire n'est pas appropriée.

Solution possible:

  1. Utilisez du lysozyme (pour Gram négatif) ou de la lysostaphine (pour Gram positif) à une concentration finale de 1 µg / ml en plus des pratiques de lyse.
  2. Augmenter le temps d'incubation (pour la lyse en ébullition et la lyse chimique) et le temps d'exposition (pour la sonication et l'homogénéisation).

Problème: Aucune amplification appropriée dans la réaction en chaîne de la polymérase.

Cause possible: Peut être dû à une contamination élevée en protéines.

Solution possible:

  1. La méthode au phénol-chloroforme peut être effectuée après la lyse de la cellule pour obtenir une forme plus pure d'ADN.
  2. La contamination par l'ARN peut être évitée par addition de RNase au lysat.