Lyse cellulaire
Avant L’extraction d’ADN une lyse cellulaire doit être fait pour faire sortir du matériel génétique de l’echantillon , Il existe différentes méthodes de préparation des lysats cellulaires telles que l'ébullition, la sonication, l'homogénéisation, la lyse enzymatique, la congélation, le broyage, etc. La lyse est la destruction de la membrane d'une cellule biologique par un agent physique, chimique ou biologique, provoquant la mort de la cellule. Les lysines sont les molécules capable de la provoquer. Les produits résultant de cette désintégration sont appelés lysats. Les principes de toutes les techniques et méthodes disponibles ont été fournis ci-dessous.
Les bactéries représentent une forme de vie beaucoup plus simple. Ils manquent de paroi cellulaire rigide, de membrane nucléaire et organisation génétique complexe. Cela aide finalement les chercheurs à effectuer de nombreuses expériences en les prenant comme organismes modèles.
Pour toute étude de biologie moléculaire des bactéries, l'extraction de son matériel génétique est un préalable indispensable. Cependant, pour l'extraction rapide de l'ADN brut total des cellules bactériennes, une simple lyse de la paroi cellulaire bactérienne et de la membrane cellulaire résoudra le problème. En raison du manque de membrane nucléaire, certains réactifs physiques et / ou chimiques peuvent être utilisés pour lyser la cellule afin d'extraire l'ADN cellulaire dans le milieu aqueux, ce qui peut être utilisé pour de simples investigations telles que l'amplification de gènes en PCR, la détection des gènes résistants aux antibiotiques et autres.
La préparation de lysat est très utile en microbiologie environnementale et clinique. Au cours des investigations microbiologiques cliniques, le temps est un facteur crucial dans le diagnostic de la maladie et caractérisation de l'agent pathogène potentiel en termes de résistance aux antibiotiques et de pathogénicité. Par conséquent, au lieu de procéder à une isolation beaucoup plus longue de l'ADN génomique ou du plasmide, de nombreux laboratoires préfèrent utiliser des lysats bactériens comme matrices pour une utilisation ultérieure dans la détection des gènes.
L’utilisation de lysats bactériens présente de nombreux avantages par rapport à d’autres pratiques classiques du fait qu’elle prend moins de temps et nécessite moins d’expertise. Il peut être réalisé sans utiliser d'instruments sophistiqués dans toutes les conditions de laboratoire.
À ce jour, il existe de nombreux rapports sur l'utilisation de lysats bactériens comme matrices pour l'identification des souches par amplification du gène de l'ARN ribosomal (r) 16S, analyse du génotype des isolats résistant aux antibiotiques, détection des gènes de virulence présents ou non dans le génome bactérien. Ainsi, des informations préliminaires correctes et précises peuvent être obtenues en utilisant des lysats bactériens plutôt qu'en utilisant l'ADN génomique ou l'ADN plasmidique de bactéries, ce qui prend un temps relativement plus long.
Principes des techniques de lyse cellulaire
Il existe différentes méthodes de préparation des lysats cellulaires d'E. Coli, telles que l'ébullition, la sonication, l'homogénéisation, la lyse enzymatique, la congélation, le broyage, etc. Les principes de toutes les pratiques disponibles ont été fournis ci-dessous.
Ebullition/Boiling
L'ébullition est la technique la plus courante de préparation des lysats de cellules bactériennes. Pendant l'ébullition, une température de 100 ° C est requise. Lorsqu'elles sont incubées dans ces conditions pendant 10 minutes, la membrane cellulaire d'une bactérie se rompt par dénaturation des protéines membranaires. Dans ce processus, une température élevée provoque également la dénaturation de l'ADN bactérien, qui peut être renaturé en conservant le produit de lyse sur de la glace pendant au moins 5 minutes. Une fois centrifugés à la vitesse maximale, les débris cellulaires autres que l'ADN et l'ARN précipitent au fond pour former le culot, et le surnageant peut être utilisé comme matrice pour d'autres expériences.
Sonication
La sonication est la technique la plus populaire pour lyser une petite quantité de cellules bactériennes. Dans ce processus, les cellules sont lysées par cisaillement liquide et cavitation. L'ADN est également cisaillé par sonication; par conséquent, il n'est pas nécessaire d'ajouter de la DNase à la suspension cellulaire. Cependant, le principal problème associé à cette pratique est le contrôle de la température.
Ce problème peut être résolu en maintenant la suspension de cellules sur de la glace et en utilisant des impulsions courtes avec des pauses pour rétablir une température basse. La grande quantité de cultures bactériennes pourrait poser des problèmes supplémentaires, car il faut une longue durée de sonication pour parvenir à une lyse adéquate, de sorte qu'il devient difficile de maintenir la température basse.
Le dispositif utilisé pour la préparation des lysats bactériens est l'homogénéisateur. Dans ce processus, les cellules bactériennes se lysent en raison de la pression élevée dans la suspension cellulaire, suivie par une libération soudaine de la pression. Cela crée finalement un cisaillement liquide capable de lyser les cellules bactériennes. Cependant, la pression de fonctionnement élevée dans ces homogénéisateurs augmente finalement la température ; par conséquent, les cellules lysées doivent être refroidies à 4 °C avant utilisation. En outre, des agents antimousses peuvent être utilisés au cours de ce processus, car la mousse générée peut inactiver de nombreuses protéines.
Lyse enzymatique
La lyse enzymatique est basée sur la digestion de la couche de peptidoglycane de la paroi cellulaire bactérienne par l'utilisation de lysozyme. Cependant, dans le cas de bactéries à Gram négatif, une couche supplémentaire est présente sur la paroi cellulaire, laquelle doit être perméable pour que le lysozyme puisse agir sur la composition en peptidoglycane de la paroi cellulaire. Dans ce contexte, le Tris, qui est souvent utilisé comme tampon dans les méthodes de lyse, augmente efficacement la perméabilité de la membrane externe. Ce processus peut être amélioré par l'addition d'EDTA qui chélate les ions magnésium pour stabiliser la membrane cellulaire. Dans ce processus de lyse cellulaire, une grande quantité d'ADN est libérée dans la solution et celle-ci devient très visqueuse et, afin de diminuer la viscosité de la solution, de la RNase et de la protéinase-K peuvent éventuellement être ajoutée.
Congélation et broyage
La méthode de lyse alternative des bactéries consiste à alterner la congélation et le broyage. Dans cette méthode, les cellules sont congelées directement dans de l'azote liquide, et les cellules congelées sont réduites en poudre à l'aide de mortier et de pilon. La poudre obtenue peut être conservée indéfiniment à -80 °C et les lysats de cellules peuvent être préparés en ajoutant la poudre à 5 volumes de tampon TE.
0 Commentaires