Extraction d'ADN de sols, de sédiments, de biofilms et de champignons | Bioeduc

Extraction d'ADN de sols, de sédiments, de biofilms et de champignons

Les progrès réalisés dans les technologies de séquençage ont rendu plus facile l'étude de l'écologie microbienne et de la dynamique des communautés. La première étape cruciale de ces analyses est la récupération efficace et représentative de l'ADN compétent en PCR à partir d'échantillons environnementaux complexes. Tous les protocoles d'extraction comportent des biais inhérents, ce qui signifie que le choix de la méthode implique un compromis entre divers facteurs, notamment l'efficacité, le rendement, l'universalité et l'extraction représentative. Ici, les détails sont donnés pour une méthode de routine utilisée dans notre laboratoire pour extraire l'ADN des sols, des sédiments, des biofilms, des racines et des champignons.

Protocole d'extraction d'ADN de sols, de sédiments, de biofilms et de champignons

Les échantillons sont homogénéisés par battement des billes, précipitation sélective de protéines et de polysaccharides et ADN purifié par absorption sur du lait de verre.

1. Peser 200 à 400 mg d'échantillon environnemental (sol ou sédiment) dans un tube en E à matrice de lyse. Pour les biofilms, les matières fécales, les lichens, les champignons ou les hyphes de champignons, un échantillon de 100 à 200 mg doit être utilisé. Dans le cas de biofilms diffus ou de cellules planctoniques, celles-ci peuvent être collectées par centrifugation et remises en suspension dans 780 µl de tampon phosphate avant leur transfert dans le tube matriciel à lyse.
2. Ajouter 780 μl de tampon phosphate et 122 μl de tampon MT.
3. Serrer le bouchon à vis sur le tube en veillant à ce qu'aucun échantillon ne soit coincé entre la jante et le joint torique interne.
4. Charger les tubes dans la machine FastPrep et traiter pendant 30 s à 5,5 m / s. Si un matériau ne semble toujours pas homogénéisé, traitez-le pendant 30 secondes supplémentaires après avoir attendu 1 minute pour que les tubes refroidissent. Si les échantillons d'origine étaient secs, laissez les tubes incuber à la température ambiante pendant 15 min à 2 h avant de procéder à la centrifugation. Cela améliore l'efficacité de l'extraction.
5. Centrifuger pendant 5 min à 14 000 × g pour agglomérer les billes et les débris de sol.
6. Récupérer 600 µl de surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml
7. Ajouter 150 µl de solution de précipitation de protéines et mélanger doucement au vortex. Tenez à la température ambiante pendant quelques minutes pour permettre au précipité de se former.
8. Centrifuger pendant 5 min à 14 000 × g pour sédimenter les protéines et les polysaccharides.
9. Récupérer 700 µl du surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml.
10. Ajouter 700 μl de matrice de liaison et bien mélanger avec le surnageant. Les tubes peuvent être placés sur un rotateur pendant 5 minutes pour augmenter l'efficacité de la liaison à l'ADN.
11. Tournez les tubes par impulsion pour obtenir le lait de verre, qui contient maintenant l'ADN lié.
12. Décanter le surnageant et remettre en suspension doucement le lait en verre dans 800 µl de tampon de lavage. Les tubes peuvent être placés sur un rotateur pendant 5 minutes pour augmenter l'efficacité du lavage.
13. Pulser les tubes par centrifugation pour obtenir le lait de verre lavé et décanter le tampon de lavage utilisé. Si le tampon de lavage est marron ou coloré, l’étape 12 peut être répétée.
14. Remettre les tubes dans la centrifugeuse et centrifuger pour collecter le surnageant restant au fond du tube.
15. Retirer soigneusement le surnageant restant avec une micropipette.
16. Sécher le culot à l'air pendant quelques minutes.
17. Remettre en suspension le culot de lait de verre dans 200 μl de tampon TE. Assurez-vous que le culot est complètement remis en suspension et laissez le TE éluer l'ADN à température ambiante pendant 5 min. L'élution peut être améliorée par une incubation à 50 ° C dans un bain-marie ou un bloc chauffant.
18. Centrifuger pendant 2 min à 14 000 × g.
19. Récupérer 160 ul du surnageant, qui contient maintenant l'ADN de l'environnement.
20. Transférer dans un tube étiqueté frais et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation.

Cette méthode fonctionne bien pour les échantillons de sol, les échantillons de sédiments marins et d'eau douce, les biofilms et les fèces. Il peut également être utilisé pour extraire l’ADN de cultures fongiques pures cultivées sur du cellophane sur des plaques d’agar-agar ou de champignons, de crapauds et de lichens.