Quantification et dosage de l'ARN pour RT-PCR

La quantification et le dosage des acides nucléiques, y compris l'ARN (Acide ribonucléique), est l'étape la plus importante et la plus nécessaire après l'achèvement de la pratique d'extraction des acides nucleiques ADN ou ARN. L'extraction des acides nucléiques se fait toujours par lyse cellulaire qui libère l'ADN (Acide désoxyribonucléique) ou l'ARN (Acide ribonucléique) dans le milieu d'extraction. L'analyse qualitative et quantitative de l'extraction de l'ARN est essentielle après chaque extraction car la qualité de l'ADN ou de l'ARN pourrait affecter les résultats de la PCR . La PCR est une technique de biologie moléculaire appliquée dans tous les laboratoires de biologie moléculaire et consiste à amplifier des fragments de l'ADN cible par exemple l'ARN 16S des bactéries. Dans le cas de l'ARN, on utilise une RT-PCR qui retranscrit l'ARN par transcriptase inverse en ADN avant l'étape d'amplification par l'enzyme polymérase (taq polymérase). La qualité de l'acide nucléique extrait peut être prédite par spectrophotométrie UV-Vis (Nannodrop) ou par électrophorèse sur gel d'agarose.

Quantification et dosage de ARN

Spectrophotomètre (NanoDrop)

La méthode traditionnelle d'évaluation de la concentration et de la pureté de l'ARN est la spectroscopie UV-Vis. Dans cette technique, l'absorbance d'un échantillon d'ARN dilué est mesurée à 260 et 280 nm, et la concentration en acide nucléique est calculée à l'aide de la loi de Beer-Lambert.

Loi de beer-lambert

Où,

loi de beer-lambert
  1. A = absorbance à une longueur d'onde particulière
  2. C = concentration d'acide nucléique
  3. I = trajet de la cuvette du spectrophotomètre
  4. ε = le coefficient d'extinction [ε pour l'ARN est de 0,025 (mg/ml)-1cm-1.
dosage des acides nucleiques par nanodrop

Conditionnement de dosage des acides nucleiques

En utilisant cette équation, une lecture A260 de 1,0 équivaut à ~ 40 µg/ml d'ARNs. Le rapport A260/A280 est utilisé pour accéder à la pureté de l'ARN. Un rapport "A260/280" de 1,8-2,1 indique un ARN hautement purifié. De plus, "A260/280" dépend à la fois du pH et de la force ionique. L'exemple de variation du rapport A260/280 est le suivant :

  1. Eau traitée par DEPC (pH 5-6) =1,60 ;
  2. Eau exempte de nucléase (pH 6-7) =1,85 ;
  3. TE (pH 8,0) = 2,14.