Principe de la PCR

Après l'isolement et l'extraction de l'ADN, l'étape d'amplification des gènes ciblés commencera. La lyse des cellules par différents protocoles d'extraction des acides nucléiques est la première étape pour réaliser le protocole de PCR après avoir obtenu les échantillons pour l'analyse génomique par les outils de biologie moléculaire. Le lysat d'extraction est soumis à des étapes de purification et de contrôle de qualité avant la PCR .

Quels sont les réactifs de la PCR ?

L'amplification de l'ADN par PCR ou réaction de polymérase en chaîne est une technique largement utilisée. La technique PCR implique l'utilisation de plusieurs réactifs qui sont essentiels pour l'application du protocole d'amplification, tels que la matrice d'ADN, l'enzyme polymérase (taq ploymerase), les amorces des gènes ciblés, les dNTP (désoxyribonulcleotides), le tampon avec MgCl2+ et H2O.

Pour le protocole PCR, un mélange de PCR est préparé dans un tube eppendorf et le mélange est fractionné dans des tubes PCR de 200 µl avec un volume final de 25 µl par échantillon d'ADN.

Rôle de Matrice d'ADN

La matrice d' ADN est le modèle qui contient la région de l'ADN cible qui doit être amplifiée. Toutefois, il convient d'utiliser une concentration adéquate d'ADN matrice avant de procéder à l'amplification par PCR. Environ 104 copies d'ADN cible de haute qualité sont nécessaires pour détecter le produit en 25-30 cycles. 1 pg à 1 ng de matrices plasmidiques ou virales peut être utilisé, alors que pour les matrices génomiques, il faut utiliser 1 ng à 1 pg. Pour l'amplification de l'ARNr 16S, la matrice d'ADN à utiliser est la suivante : pureté OD260/OD280 =1,8-2,0, concentration ≥50 ng/µl, la quantité d'ADN est d'au moins 5 µg.

reactifs de pcr

Rôle des Amorces Forward et Reverse

L'ADN étant une structure hélicoïdale polynucléotidique à double brin (ds), un brin part de la direction 5ʹ-3ʹ, et l'autre brin part de la direction 3ʹ-5ʹ (complémentaire au premier brin), et la synthèse de l'amorce a toujours lieu dans la direction 5ʹ-3ʹ, quel que soit l'endroit où elle est présente. Par conséquent, une amorce est nécessaire dans le sens direct (Forward) et une autre dans le sens inverse (Reverse) . Pour une amplification correcte du produit, la concentration finale des amorces 16S doit être de 0,05-1 µM. Comme les amorces ont une plus grande influence sur le succès ou l'échec des protocoles de PCR, il est ironique que la conception des amorces soit en grande partie qualitative et qu'elle repose sur des principes thermodynamiques ou structurels bien compris. La série d'amorces à utiliser au cours de cette expérience est la suivante :
16S Amorce Forward 27F -
5' AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3'
16S Amorce Reverse 1492R -
5' ACGGCTACCTTGTTACGA 3'

Rôle de Taq Polymerase

La Taq polymérase est une ADN polymérase thermostable isolée de la bactérie thermophile Thermus aquaticus, qui a été isolée à l'origine par Thomas D. Brock en 1965. L'enzyme est capable de résister aux conditions de dénaturation des protéines requises lors de la PCR. Elle a la température optimale pour son activité entre 75 et 80°C, avec une demi-vie de plus de 2 h à 92,5°C, 40 min à 95°C et 9 min à 97,5°C et possède la capacité de répliquer une séquence d'ADN de 1000 pb en moins de 10 s à 72°C. Toutefois, le principal inconvénient de l'utilisation de la Taq polymérase est la faible fidélité de réplication, car elle ne possède pas d'activité de lecture de preuve de l'exonucléase 3ʹ-5ʹ.

Elle produit également des produits d'ADN dont les extrémités 3ʹ sont en porte-à-faux, ce qui est utile en fin de compte lors du clonage TA. En général, 0,5-2,0 unités de Taq polymérase sont utilisées dans une réaction totale de 50 µl, mais l'idéal serait d'utiliser 1,25 unités.

Rôle de Triphosphate de désoxynucléotide DNTP

Les dNTP sont les éléments constitutifs du nouveau brin d'ADN. Dans la plupart des cas, ils se présentent sous la forme d'un mélange de quatre désoxynucléotides, à savoir dATP, dTTP, dGTP et dCTP. Environ 100 µM de chacun des dNTP sont nécessaires par réaction PCR. Les stocks de dNTP sont très sensibles aux cycles de décongélation et de congélation et après 3 à 5 cycles, les réactions PCR ne fonctionnent pas bien. Pour éviter ces problèmes, de petites aliquotes (2-5 µl) ne durant que quelques réactions peuvent être réalisées et conservées congelées à -20 °C. Cependant, pendant la congélation à long terme, une petite quantité d'eau s'évapore sur les parois du flacon, modifiant ainsi la concentration de la solution de dNTPs. Il est donc essentiel de centrifuger les flacons avant de les utiliser, et il est toujours recommandé de diluer les dNTP dans un tampon TE, car un pH acide favorise l'hydrolyse des dNTP et interfère avec le résultat de la PCR.

Rôle de Solution tampon

Chaque enzyme a besoin de certaines conditions en termes de pH, de force ionique, de cofacteurs, etc., ce qui est obtenu par l'ajout d'un tampon au mélange réactionnel. Dans certains cas, l'enzyme modifie le pH dans une solution non tamponnée et cesse de travailler dans ce processus, ce qui peut être évité par l'ajout d'un tampon PCR. Dans la plupart des tampons PCR, la composition est presque la même que : 100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2+ et 0,01% (p/v) de gélatine. La concentration finale du tampon PCR doit être de 1× la concentration par réaction.

Rôle de Divalent Cation MgCl2+

Le mécanisme de l'ADN polymérase nécessite la présence de cations divalents. Pour l'essentiel, ils protègent la charge négative du triphosphate et permettent à l'oxygène hydroxylé du carbone 3ʹ d'attaquer le phosphore du groupe alpha-phosphate attaché au carbone 5ʹ du nucléotide entrant. Toutes les enzymes qui rompent les liaisons phosphoanhydride des di- et tri-phosphates de nucléoside nécessitent la présence de cations divalents. Une solution de MgCl2 de 1,5 à 2,0 mM est optimale pour l'activité de la Taq ADN polymérase. Si MgCl2+ est trop faible, aucun produit de PCR ne sera visible, tandis que si MgCl2+ est trop élevé, un produit de PCR indésirable peut être obtenu.