Principe de la PCR
La PCR (Réaction en chaine par polymérase) est une réaction en chaîne dans laquelle un petit fragment d'ADN sert de modèle pour produire les grands nombres de copies. Une molécule d'ADN produit deux copies, puis quatre, puis huit et ainsi de suite. Ce doublement continu est accompli par des protéines spécifiques connues sous le nom de polymérase. La polymérase de l'ADN nécessite également des éléments constitutifs de l'ADN, les bases nucléotidiques, c'est-à-dire l'adénine (A), la thymine (T), la cytosine (C) et la guanine (G). Un petit fragment d'ADN appelé amorce est également nécessaire, auquel les éléments constitutifs sont fixés et la molécule d'ADN existante sert de modèle pour la construction du nouveau brin. Lorsque les ingrédients sont fournis, l'enzyme construit les copies exactes de la matrice. De cette façon, le nombre de copies d'ADN obtenues après "n" cycles est de 2n+1.
La PCR peut être considérée comme la synthèse d'ADN in vitro qui nécessite les mêmes molécules précurseurs que dans le cas de la réplication de l'ADN in vivo. L'ADN polymérase a été remplacée par une polymérase thermostable appelée Taq ADN polymérase qui peut résister à une température de >90 °C avec une activité optimale de 72 °C. Les amorces d'ARN dans la réplication de l'ADN ont été remplacées par des amorces d'oligonucléotides, dont la conception est le facteur le plus important qui influence l'efficacité et la spécificité de la réaction d'amplification.
Les désoxyribonucléotides ont été utilisés comme concentration équimolaire de quatre d'entre eux (dATP, dTTP, dGTP, dCTP). Comme l'ADN polymérase thermostable a besoin de cations libres-divalents pour son activité optimale, le Mg2+ est souvent utilisé à cette fin, ainsi que, dans certains cas, le Mn2+. Pour maintenir le niveau de pH dans les tubes de réaction, un tampon a été ajouté pour maintenir le pH entre 8,3 et 8,8. L'ADN modèle est la condition préalable indispensable à une PCR, qui peut être ajouté sous forme de simple brin ou de double brin. Pour fonctionner au mieux, la PCR ne nécessite qu'une seule copie de la séquence cible comme matrice.
La PCR est un processus itératif comprenant trois étapes de régulation de la température, c'est-à-dire la dénaturation de la matrice, l’hybridation des amorces oligonucléotidiques à la séquence cible ss et l'extension de l'amorce fixée par l'ADN polymérase thermostable.
La dénaturation de l'ADNdb dépend de sa teneur en G + C. Plus la proportion de G + C est élevée, plus la température requise pour la séparation des brins de l'ADN matrice est élevée. Plus l'ADN matrice est long, plus le temps nécessaire pour séparer complètement deux brins est élevé. Dans la PCR catalysée par la Taq polymérase thermostable, la dénaturation s'effectue normalement à 94-95°C, ce qui est dû au fait que l'enzyme peut supporter 30 cycles ou plus sans subir de dommages importants. L'étape la plus cruciale d'une PCR est l’hybridation. Si la température d'hybridation est trop élevée, les amorces oligonucléotidiques s'hybrident mal pour produire un ADN mal amplifié. Au contraire, si la température d'annelage est trop basse, un annelage non spécifique des amorces peut se produire, entraînant l'amplification de segments indésirables de l'ADN matrice. Il est toujours recommandé que la température d'annelage soit inférieure de 3 à 5 °C à la température de fusion calculée des deux amorces oligonucléotidiques. L'extension des amorces oligonucléotidiques est toujours effectuée à la température optimale pour la synthèse d'ADN catalysée par une ADN polymérase thermostable, c'est-à-dire 72-78°C.
Un autre facteur important de l'amplification de l'ADN par PCR est le nombre de cycles qui dépend du nombre de copies de l'ADN matrice présent au début de la réaction. Une fois établie dans la phase géométrique, la réaction se poursuit jusqu'à ce que l'un des composants devienne limitant. C'est généralement le cas qu'après ~30 cycles, la réaction contient ~ 105 copies de la séquence cible et de la Taq polymérase (efficacité ~ 0,7). Au moins 25 cycles sont nécessaires pour atteindre des niveaux acceptables d'amplification des séquences cibles d'une seule copie des matrices d'ADN.
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