Extraction de l'ARN total des bactéries
le dogme central de la vie suggère que l'ADN héberge toutes les informations à code pour une protéine par l'ARN. Par conséquent, dans le cas de systèmes bactériens, l'ARN emploie de nombreuses fonctions, à savoir:
- Agit comme catalyseurs pour la plupart des réactions biochimiques
- Agit comme porteur d'acides aminés pendant la synthèse des protéines
- Agit comme un transmetteur d'informations génétiques à leur fonction respective
- Agitcomme un modèle pour la synthèse des protéines.
Ainsi, l'ARN dans les bactéries est la macromolécule biologique omniprésente qui remplit de nombreux rôles cruciaux de codage, décodage, régulation et expression des gènes.
Il existe différents types d'ARN trouvés dans les systèmes eucaryotes; cependant, dans les systèmes procaryotes, on trouve de l'ARN messager de transfert (ARNt), qui marque les protéines codées par les ARNm et manque de codons d'arrêt pour la dégradation et empêche le ribosome de caler. De plus, les bactéries possèdent également de petits ARN (ARNs), qui sont de petites molécules d'ARN non codant (50–250 nucléotides) qui sont hautement structurées et contiennent plusieurs boucles de tige. Bien que moins exploré, l'ARNs dans les bactéries est censé avoir son rôle dans la liaison des cibles protéiques, la liaison aux cibles ARNm et donc la régulation de l'expression des gènes. L'ARNmt peut former un complexe de ribonucléoprotéines (tmRNP) avec une petite protéine B (SmpB), un facteur d'allongement Tu (EF-Tu) et une protéine ribosomique S1. Dans la majorité des systèmes bactériens, les fonctions souhaitées ont été réalisées par des ARNtm monoblocs standard. Cependant, dans certaines espèces bactériennes, le gène ssrA produit parfois un ARNtm en deux parties où deux chaînes d'ARN distinctes sont jointes par appariement de bases.
Le meilleur exemple d'un ARNs bactérien est l'ARN 6S trouvé dans E. coli. L'ARN 6S est conservé dans de nombreuses espèces bactériennes et joue un rôle important dans la régulation des gènes. Cet ARN a un impact majeur sur l'activité de l'ARN polymérase (RNAP), qui transcrit l'ARN de l'ADN. L'ARN 6S inhibe son activité en se liant à une sous-unité de polymérase pour stimuler la transcription pendant la croissance. Ce mécanisme d'inhibition de l'expression des gènes oblige les cellules en croissance active à entrer dans une phase stationnaire. Une autre classe majeure d'ARN bactérien est l'ARNr, qui est généré par le traitement par endonucléase d'un transcrit précurseur. Ainsi, le clivage de ce transcrit produit des molécules d'ARNr 5S, 16S, 23S et une molécule d'ARNt.
Principe d'Extraction de l'ARN total par Trizol
Le réactif Trizol est largement utilisé de nos jours pour l'extraction d'ARN à partir de cellules bactériennes. C'est la méthode la plus courante développée par Chomczynski et Sacchi (1987). Bien que cela prenne un peu plus de temps que les méthodes basées sur des colonnes disponibles dans le commerce, il a une grande capacité à produire plus d'ARN. Tout en utilisant les tampons de lyse chaotropes, cette méthode est considérée comme fournissant la meilleure qualité d'ARN.
L'ARN est la substance polymère constituée de longues chaînes ss d'unités de phosphate et de sucre ribose avec les bases azotées comme l'adénine, la guanine, la cytosine et l'uracile. L'ARN est utilisé à toutes les étapes de la synthèse des protéines dans tous les systèmes vivants; par conséquent, son isolement et sa caractérisation approfondie révèlent les principales caractéristiques importantes concernant la synthèse des protéines et l'analyse de l'expression des gènes. Ainsi, l'isolement d'ARN de haute qualité est l'étape la plus cruciale de diverses études de biologie moléculaire.
À cet égard, le trizol est le réactif prêt à l'emploi pour l'isolement de l'ARN des cellules et des tissus. Trizol fonctionne en maintenant l'intégrité de l'ARN pendant l'homogénéisation des tissus et une extraction ultérieure de celui-ci. En même temps, il perturbe la membrane cellulaire ainsi que d'autres composants cellulaires. L'addition de chloroforme sépare toujours la solution en deux phases, à savoir la phase aqueuse et la phase organique pour faciliter l'isolement de l'ARN dans la phase aqueuse.
En phase aqueuse, l'ARN peut être récupéré davantage par précipitation avec de l'alcool isopropylique. De plus, l'ADN et les protéines peuvent être récupérés par séparation séquentielle en éliminant la phase aqueuse. La précipitation de l'interphase par l'éthanol donne de l'ADN et une précipitation supplémentaire avec de l'alcool isopropylique nécessite des protéines de la phase organique (Fig.). Comme le trizol donne une forme pure d'ARN exempte de contaminations de protéines et d'ADN; par conséquent, il peut être utilisé pour d'autres applications en aval telles que l'analyse Northern blot, la traduction in vitro, la sélection poly (A), le test de protection RNase ainsi que le clonage moléculaire.
L'extraction d'ARN à partir de n'importe quel système vivant est confrontée à un énorme défi en raison de la présence omniprésente d'enzymes ribonucléases dans les cellules, qui peuvent rapidement dégrader l'ARN. Ainsi, l'obtention d'un ARN de haute qualité est la condition préalable indispensable avant d'effectuer d'autres expériences de biologie moléculaire comme la réaction en chaîne quantitative en temps réel de la polymérase (qRTPCR). Pour générer les résultats les plus sensibles et les plus pertinents sur le plan biologique, la pratique de l'isolement d'ARN doit inclure certaines étapes importantes avant, pendant et après l'extraction réelle de l'ARN. Ainsi, trois aspects importants doivent être gardés à l'esprit pour une extraction efficace de l'ARN des bactéries, à savoir:
- Le traitement et la manipulation des échantillons avant l'isolement de l'ARN
- Le choix de la technique utilisée pour l'extraction de l'ARN
- Le stockage de l'échantillon d'ARN préparé.
A voir aussi Protocoles de biologie moléculaire
Protocoles de biologie moléculaire
- Extraction d'ADN plasmidique bactérien
- Purification et Contrôle de la qualité de l'ADN
- Extraction d'ADN à partir de racines et des feuilles de plantes
- Extraction d'ADN de sols, de sédiments, de biofilms et de champignons
- Comment choisir les séquences d'amorce d'ADN ?
- Processus d'amplification de l'ADN par PCR
- Extraction d'ADN plasmidique bactérien
- Extraction d'ADN plasmidique par lyse alcaline rôle des réactifs
0 Commentaires