Génie Génétique, Clonage et ADN recombinant
La biologie moléculaire et génie génétique (BMGG) est la modification délibérée de l’information génétique d’un organisme en modifiant directement son génome d’acide nucléique, et est accomplie par un ensemble de méthodes connues sous le nom de technologie de l’ADN recombinants et le clonage et consiste à utiliser les plasmides comme vecteurs de clonage.
Tout d'abord, l'ADN responsable d'un phénotype particulier est identifié et isolé. Une fois purifié, le gène ou les gènes sont fusionnés avec d'autres fragments d'ADN pour former des molécules d'ADN recombinant. Celles-ci se propagent (clonage de gènes) par insertion dans un organisme qui n'a même pas besoin d'être dans le même royaume que le donneur de gène d'origine.
La technologie de l'ADN recombinant ouvre de nouveaux domaines de recherche et de biologie appliquée. C'est donc un élément essentiel de la biotechnologie, qui connaît actuellement une phase de croissance et de développement exceptionnellement rapide. Bien que le terme ait plusieurs définitions, dans ce texte, la biotechnologie fait référence aux processus dans lesquels les organismes vivants sont manipulés, en particulier au niveau de la génétique moléculaire, pour former des produits utiles. La promesse pour la médecine, l’agriculture et l’industrie est excellente; pourtant, les risques potentiels de cette technologie ne sont pas complètement connus et peuvent être considérables.
Les méthodes de la biologie moléculaire sont essentiellement basées sur l’hybridation entre les bases purique (A et G) et pyrimidiques (C, T et U). Grace à ces lois de complémentarité, il est possible d’associer un brin d’acide nucléique avec une sonde et de reconnaitre le gène ou la séquence étudiée.
Les sondes permettent de détecter des séquences uniques de génome. Il est ensuite possible d’amplifier une séquence de gène présente en un nombre limité d’exemplaires dans l’échantillon.
Les enzymes de restriction permettent de couper l’ADN dans des endroits précis.
L’électrophorèse permet de séparer les segments ADN obtenus en fonction de leurs poids moléculaires.
la technologie de génie génétique et de l'adn recombinants ont permit a:
- Connaissance de la physiologie moléculaire ; contenu de la cellule.
- Détermination des séquences des gènes;
- Connaissance sur les mécanismes de régulation de l’expression des gènes de pathologie moléculaire
- Diagnostic des maladies héréditaires
- Elle contribue au conseil génétique
Elle possède des applications en médecine légale comme :
- La reconnaissance des personnes lors des grandes catastrophes
- La reconnaissance de paternité
La destruction des individus en criminologie mis en œuvre l'empreinte génétique permettant d'identifier sans erreur un individu à partir d'un échantillon de son ADN, Les matériaux qui sont typiquement recherchés sont le sang, les poils et plumes, la salive, les excréments, des échantillons de peau ou de mucus ainsi que d’autres types de tissus. La principale méthode utilisée pour analyser ces matériaux est l’analyse ADN.
Rôles des enzymes dans la généie génétique
Qu'est qu'un Enzyme de restriction ?
Les Enzymes de restrictions sont des molécules extraites à partir de microorganismes (généralement des bactéries) et qui coupent les liaisons phospho-diester au niveau des acides nucléiques.
Exonucléases
Les exonucléases sont des enzymes de restrictions utilisés dans un grnad échelle dans la génie génétique et la technologie de l'ADN recombinants et le clonage, ellles digèrent l'ADN à partir de l'extrémité 5' ou 3'.
Endonucléases
Les endonucléases sont des enzymes de restrictions utilisés dans un grnad échelle dans la génie génétique et la technologie de l'ADN recombinants et le clonage, elles coupent l'ADN à l'intérieur en cassant les liaisons phospho-diester. elles coupent au niveau des sites spécifiques appelés « sites de restrictions », ces sites sont de nature palindromique, c'est-à-dire que la lecture des deux brins complémentaires dans des sens opposés donne la même séquence.
Il y a deux catégories d'endo-nucléases : celles qui donnent des extrémités franches et celles qui donnent des extrémités cohésives. d’où la possibilité de lier des fragments d’ADN d’origine différentes : c’est le phénomène de la recombinaison génétique.
Il existe trois types d’enzymes de restriction:
- Les enzymes de type I et III ne sont pas utilisées en pratique, car elles coupent l’ADN de façon aléatoire.
- Les enzymes de restriction de type II, clivent spécifiquement les deux brins d’ADN au niveau d’une séquence bien définie. Elles ont la particularité de reconnaitre et de couper des séquences palindromiques.
ADN polymérases
Le role de l'adn polymérase consiste a réaliser des liaisons phospho-diester entre deux nucléotides adjacents, l'un des plus important enzyme de plymérase est le taq qui utilisé dans la réaction de polymérase en chaine "PCR"
Fragment de Klenow
c'est un fragment d'ADN obtenu par une digestion enzymatique de la polymérase I d’E.coli.Ce fragment conserve l’activité polymérase et exonucléase 3’→5’ et perd l’activité exo-nucléase 5’→3’.
Le fragment de Klenow permet le séquençage de l’ADN , selon la méthode de Sanger : la synthèse de second brin d’un ADN complementaire et le marquage isotopique au P32 de l’extrémité 3’ de l’ADN par échange de nucléotides froids contre des nucléotides marqués au P32.
Taq polymérase
L'enzyme Taq polymérase est extraite à partir d’une bactérie Thermus aquaticus , Active à 70°C, utilisée dans la technique PCR, en vue d’une amplification de l'ADN in vitro.
Vecteurs de clonage
les vectuers de clonage sont des molécules d’ADN construites à partir de plasmides ou de virus (cosmides), qui permettent le transfert de gènes entre cellules.
Tous les vecteurs possèdent un poly-linker refermant plusieurs sites de restriction, où on peut ouvrir le vecteur pour insérer une séquence d’ADN et un gène de résistance aux antibiotiques.
Le gène de résistance permet de sélectionner les cellules qui ont reçu le vecteur après transfection.
Il existe deux grandes catégories de vecteurs :
- Vecteur de clonage
- Vecteur d'expression
Un vecteur de clonage renferme une origine de réplication Ori V , il permet de cloner un segment d'ADN ou un gène qui y est intégré.
Un vecteur de clonage renferme un promoteur, il permet de faire exprimer un gène Schéma simplifié.
Sondes moléculaires
Séquence d'ADN monocaténaire, marquée, complémentaire du gène recherché, son rôle est la détection de gènes, notamment en diagnostic génétique. Le principe consiste à détecter la présence d’une mutation ponctuelle en réalisant l’hybridation moléculaire entre la séquence à tester et la sonde de l’allèle muté.
L’utilisation d’une sonde spécifique de l’allèle normal et nécessaire pour réaliser un témoin négatif. Pour s’hybrider de façon spécifique à la séquence complémentaire, la sonde doit être courte. Les sondes sont marquées avec un élément radioactif (P32) ou chimioluminescent (digoxygénine) pour pouvoir les détecter après hybridation.
Protocoles de Biologie Moléculaire
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