Procédure et protocole d'extraction d'ADN

L'extraction de l'ADN est une technique permettant d'isoler l'ADN de cellules ou de tissus. le protocole et la procédure sont détaillés comme suit.

  1. Cultivez une culture bactérienne de 5 ml jusqu'à saturation. Centrifugez (6000 tours/minute pendant 10 min) 1,5 ml de culture pendant 2 min ou jusqu'à formation d'un culot compact.
  2. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 567 µl de tampon TE.
  3. Ajouter 30 µl de SDS à 10% et 3 µl de 20 mg/ml de protéinase-K, bien mélanger et incuber pendant 1 h à 37 ° C.
  4. Ajouter 100 µl de NaCl 5 M et bien mélanger. Si la concentration de NaCl est < 0,5 M , le l'acide nucléique peut aussi précipiter.
  5. Ajouter 80 µl de solution de NaCl et bien mélanger.
  6. Ajouter 1 volume (0,7–0,8 ml) de mélange chloroforme/alcool isoamylique 24:1, bien mélanger et centrifuger à 6000 tr/min pendant 4 à 5 min. Transférer le surnageant dans un nouveau tube.
  7. Au surnageant, ajoutez 1 volume de 25: 24: 1 phénol/chloroforme/alcool isoamylique, extraire à fond et centrifuger à 6000 tr / min pendant 5 min. Transférer le surnageant dans un tube frais.
  8. Au surnageant, ajoutez 0,6 volume d’isopropanol et mélangez doucement jusqu’à obtention précipité d'ADN blanc. Centrifuger à 10 000 tr / min pendant 10 min brièvement dans la Température ambiante, éliminer le surnageant et ajouter 100 µl d'éthanol à 70% pour obtenir un culot.
  9. Centrifuger ce mélange pendant 5 min à la température ambiante, et sécher le culot par évaporation complète de l'éthanol.
  10. Remettre en suspension ce culot sec dans 50 µl de tampon TE pour obtenir un ADN. Le rendement typique est de 5 à 20 µg ADN/ml de culture de départ (108-109 cellules/ml).
  11. Vérifier la pureté de l'ADN avec du gel d'agarose électrophorèse et nano-drop et stocker à 4 ° C dans le tampon TE jusqu'à utilisation ultérieure.
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