Principe de lyse cellulaire par Boiling

L'extraction d' ADN consiste à libérer le matériel génétique de la cellule dans le milieu. Il existe plusieurs techniques et méthodes de lyse cellulaire qui aboutit à l'extraction de l'adn génomique d'une cellule.

L'ébullition est la technique la plus courante de préparation des lysats de cellules bactériennes. Pendant l'ébullition, une température de 100 ° C est requise. Lorsqu'elles sont incubées dans ces conditions pendant 10 minutes, la membrane cellulaire d'une bactérie se rompt par dénaturation des protéines membranaires. Dans ce processus, une température élevée provoque également la dénaturation de l'ADN bactérien, qui peut être renaturé en conservant le produit de lyse sur de la glace pendant au moins 5 minutes. Une fois centrifugés à la vitesse maximale, les débris cellulaires autres que l'ADN et l'ARN précipitent au fond pour former le culot, et le surnageant peut être utilisé comme matrice pour d'autres expériences.

boiling

Porotocole de Lyse cellulaire par ébullition / Boiling

  1. Cultiver E.coli jusqu'à 0,5 McFarland suspension dans du milieu LB. Si nécessaire, diluez la culture cultivée pour obtenir des suspensions de 0,5 McFarland, une concentration particulière.
  2. Centrifuger à 6000 tr / min pendant 5 min à température ambiante.
  3. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 200 µl d'eau milli-autoclave autoclavée.
  4. Réglez le bain-marie à 100 ° C ou faites bouillir de l'eau dans un récipient.
  5. Gardez les tubes à centrifuger contenant la culture bactérienne dans de l'eau bouillante pendant 10 min.
  6. Enclenchez immédiatement les tubes à centrifuger dans de la glace pendant 5 min.
  7. Après incubation sur de la glace, centrifuger le tube à 10 000 tr/min pendant 5 min à 4 ° C.
  8. Transférer le surnageant dans un nouveau tube et conservez-le à 4 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.

Observations

Le lysat simple est l'extrait brut d'acide nucléique de la cellule bactérienne. L'analyse spectrophotométrique du lysat bactérien donne une idée claire de la quantité d'ADN présent dans celui-ci ainsi que de sa qualité.

Cet extrait brut peut être utilisé ultérieurement pour des applications telles que l'amplification de l'ADN par réaction en chaîne de la polymérase (PCR), la digestion par restriction où il y a moins de risque d'interférence par les impuretés d'ARN et de protéines.

L'absorbance à 260 nm est utilisée pour quantifier les teneurs en acide nucléique. Une valeur d'absorbance à 260 nm dans 1 ml produit une DO de 1. Ainsi, en appliquant le même facteur de conversion:

  1. 1 unité A260 ADNdb = 50 µg
  2. 1 unité A260 ADNss = 33 µg
  3. 1 unité A260 ARNss = 40 µg

Problèmes et solutions

Problème: ADN dégradé.

Cause possible : Une température plus élevée pendant l'ébullition ou la sonication peut dégrader l'ADN.

Solution possible:

  1. Après 10 minutes de lyse bouillante, étendre immédiatement sur de la glace pendant 5 minutes, de sorte qu'une grande partie de l'ADN dénaturé puisse être renaturée pour faciliter la dénaturation.
  2. La sonication génère beaucoup de chaleur. Par conséquent, la sonication peut être effectuée à des impulsions courtes avec des pauses.

Problème: Pas de rendement.

Cause possible: La lyse cellulaire n'est pas appropriée.

Solution possible:

  1. Utilisez du lysozyme (pour Gram négatif) ou de la lysostaphine (pour Gram positif) à une concentration finale de 1 µg / ml en plus des pratiques de lyse.
  2. Augmenter le temps d'incubation (pour la lyse en ébullition et la lyse chimique) et le temps d'exposition (pour la sonication et l'homogénéisation).

Problème: Aucune amplification appropriée dans la réaction en chaîne de la polymérase.

Cause possible: Peut être dû à une contamination élevée en protéines.

Solution possible:

  1. La méthode au phénol-chloroforme peut être effectuée après la lyse de la cellule pour obtenir une forme plus pure d'ADN.
  2. La contamination par l'ARN peut être évitée par addition de RNase au lysat.