Principe de Sonication ou Ultrason

L'extraction d' ADN consiste à libérer le matériel génétique de la cellule dans le milieu. Il existe plusieurs techniques et méthodes de lyse cellulaire qui aboutit à l'extraction de l'adn génomique d'une cellule.

La sonication est la technique la plus populaire pour lyser une petite quantité de cellules bactériennes. Dans ce processus, les cellules sont lysées par cisaillement liquide et cavitation. L'ADN est également cisaillé par sonication; par conséquent, il n'est pas nécessaire d'ajouter de la DNase à la suspension cellulaire. Cependant, le principal problème associé à cette pratique est le contrôle de la température.

Ce problème peut être résolu en maintenant la suspension de cellules sur de la glace et en utilisant des impulsions courtes avec des pauses pour rétablir une température basse. La grande quantité de cultures bactériennes pourrait poser des problèmes supplémentaires, car il faut une longue durée de sonication pour parvenir à une lyse adéquate, de sorte qu'il devient difficile de maintenir la température basse.

Le dispositif utilisé pour la préparation des lysats bactériens est l'homogénéisateur. Dans ce processus, les cellules bactériennes se lysent en raison de la pression élevée dans la suspension cellulaire, suivie par une libération soudaine de la pression. Cela crée finalement un cisaillement liquide capable de lyser les cellules bactériennes. Cependant, la pression de fonctionnement élevée dans ces homogénéisateurs augmente finalement la température ; par conséquent, les cellules lysées doivent être refroidies à 4 °C avant utilisation. En outre, des agents antimousses peuvent être utilisés au cours de ce processus, car la mousse générée peut inactiver de nombreuses protéines.

ultason sonication

Protocole de Sonication

  1. Inoculer 4 à 5 cultures bactériennes fraîches dans 2 ml de bouillon LB préalablement autoclavé et incuber à 37 ° C et à 180 rpm pendant une nuit.
  2. Transférer 1 ml de la suspension bactérienne dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 ml et centrifuger à 6000 tr / min pendant 5 min à 4 ° C.
  3. Jeter le surnageant et ajouter le reste de la culture au culot dans un tube à centrifuger et centrifuger à nouveau à 6000 tr / min pendant 5 min à 4 ° C.
  4. Jeter le surnageant et ajouter 600 µl d'eau stérile milli-Q et bien mélanger par vortex.
  5. Centrifuger à 6000 tr / min pendant 5 min à température ambiante et jeter le surnageant, ajouter 600 µl de tampon 1 X TE et mélanger à nouveau par vortexage.
  6. Soniquer pendant 2 min à une amplitude de 22 µm avec des impulsions brèves (5 à 10 s) et des pauses (10 à 30 s).
  7. Centrifuger à 10 000 tr / min pendant 5 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger.
  8. Stockez le surnageant à -20 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.

Observations

Le lysat simple est l'extrait brut d'acide nucléique de la cellule bactérienne. L'analyse spectrophotométrique du lysat bactérien donne une idée claire de la quantité d'ADN présent dans celui-ci ainsi que de sa qualité.

Cet extrait brut peut être utilisé ultérieurement pour des applications telles que l'amplification de l'ADN par réaction en chaîne de la polymérase (PCR), la digestion par restriction où il y a moins de risque d'interférence par les impuretés d'ARN et de protéines.

L'absorbance à 260 nm est utilisée pour quantifier les teneurs en acide nucléique. Une valeur d'absorbance à 260 nm dans 1 ml produit une DO de 1. Ainsi, en appliquant le même facteur de conversion:

  1. 1 unité A260 ADNdb = 50 µg
  2. 1 unité A260 ADNss = 33 µg
  3. 1 unité A260 ARNss = 40 µg

Problèmes et solutions

Problème: ADN dégradé.

Cause possible : Une température plus élevée pendant l'ébullition ou la sonication peut dégrader l'ADN.

Solution possible:

  1. Après 10 minutes de lyse bouillante, étendre immédiatement sur de la glace pendant 5 minutes, de sorte qu'une grande partie de l'ADN dénaturé puisse être renaturée pour faciliter la dénaturation.
  2. La sonication génère beaucoup de chaleur. Par conséquent, la sonication peut être effectuée à des impulsions courtes avec des pauses.

Problème: Pas de rendement.

Cause possible: La lyse cellulaire n'est pas appropriée.

Solution possible:

  1. Utilisez du lysozyme (pour Gram négatif) ou de la lysostaphine (pour Gram positif) à une concentration finale de 1 µg / ml en plus des pratiques de lyse.
  2. Augmenter le temps d'incubation (pour la lyse en ébullition et la lyse chimique) et le temps d'exposition (pour la sonication et l'homogénéisation).

Problème: Aucune amplification appropriée dans la réaction en chaîne de la polymérase.

Cause possible: Peut être dû à une contamination élevée en protéines.

Solution possible:

  1. La méthode au phénol-chloroforme peut être effectuée après la lyse de la cellule pour obtenir une forme plus pure d'ADN.
  2. La contamination par l'ARN peut être évitée par addition de RNase au lysat.