Principe de la digestion enzymatique

L'extraction d' ADN consiste à libérer le matériel génétique de la cellule dans le milieu. Il existe plusieurs techniques et méthodes de lyse cellulaire qui aboutit à l'extraction de l'adn génomique d'une cellule.

La lyse enzymatique est basée sur la digestion de la couche de peptidoglycane de la paroi cellulaire bactérienne par l'utilisation de lysozyme. Cependant, dans le cas de bactéries à Gram négatif, une couche supplémentaire est présente sur la paroi cellulaire, laquelle doit être perméable pour que le lysozyme puisse agir sur la composition en peptidoglycane de la paroi cellulaire. Dans ce contexte, le Tris, qui est souvent utilisé comme tampon dans les méthodes de lyse, augmente efficacement la perméabilité de la membrane externe. Ce processus peut être amélioré par l'addition d'EDTA qui chélate les ions magnésium pour stabiliser la membrane cellulaire. Dans ce processus de lyse cellulaire, une grande quantité d'ADN est libérée dans la solution et celle-ci devient très visqueuse et, afin de diminuer la viscosité de la solution, de la RNase et de la protéinase-K peuvent éventuellement être ajoutée.

Protocole de Digestion enzymatique

  1. Cultiver E. coli jusqu'à 0,5 McFarland suspension dans du milieu LB. Si possible, diluez la culture cultivée pour obtenir des suspensions de 0,5 McFarland.
  2. Dissolvez le lysozyme dans une quantité appropriée de tampon TE pour obtenir une solution à 10 mg / ml. Ajouter la poudre d’enzyme dans le tampon et le dissoudre lentement et conserver sur de la glace. Ne pas secouer ou mélanger.
  3. Ajouter 100 µl de solution mère de lysozyme (10 mg / ml) à 1 ml de culture bactérienne dans du tampon TE pour obtenir une concentration finale de 1 mg / ml.
  4. Incuber la solution à 30 ° C et agiter doucement pendant 30 min à 1 h.
  5. Centrifuger la solution à 10 000 tr / min pendant 10 min à 4 ° C et transférer le surnageant dans un nouveau flacon.
  6. Conservez le surnageant à - 20 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.

Observations

Le lysat simple est l'extrait brut d'acide nucléique de la cellule bactérienne. L'analyse spectrophotométrique du lysat bactérien donne une idée claire de la quantité d'ADN présent dans celui-ci ainsi que de sa qualité.

Cet extrait brut peut être utilisé ultérieurement pour des applications telles que l'amplification de l'ADN par réaction en chaîne de la polymérase (PCR), la digestion par restriction où il y a moins de risque d'interférence par les impuretés d'ARN et de protéines.

L'absorbance à 260 nm est utilisée pour quantifier les teneurs en acide nucléique. Une valeur d'absorbance à 260 nm dans 1 ml produit une DO de 1. Ainsi, en appliquant le même facteur de conversion:

  1. 1 unité A260 ADNdb = 50 µg
  2. 1 unité A260 ADNss = 33 µg
  3. 1 unité A260 ARNss = 40 µg

Problèmes et solutions

Problème: ADN dégradé.

Cause possible : Une température plus élevée pendant l'ébullition ou la sonication peut dégrader l'ADN.

Solution possible:

  1. Après 10 minutes de lyse bouillante, étendre immédiatement sur de la glace pendant 5 minutes, de sorte qu'une grande partie de l'ADN dénaturé puisse être renaturée pour faciliter la dénaturation.
  2. La sonication génère beaucoup de chaleur. Par conséquent, la sonication peut être effectuée à des impulsions courtes avec des pauses.

Problème: Pas de rendement.

Cause possible: La lyse cellulaire n'est pas appropriée.

Solution possible:

  1. Utilisez du lysozyme (pour Gram négatif) ou de la lysostaphine (pour Gram positif) à une concentration finale de 1 µg / ml en plus des pratiques de lyse.
  2. Augmenter le temps d'incubation (pour la lyse en ébullition et la lyse chimique) et le temps d'exposition (pour la sonication et l'homogénéisation).

Problème: Aucune amplification appropriée dans la réaction en chaîne de la polymérase.

Cause possible: Peut être dû à une contamination élevée en protéines.

Solution possible:

  1. La méthode au phénol-chloroforme peut être effectuée après la lyse de la cellule pour obtenir une forme plus pure d'ADN.
  2. La contamination par l'ARN peut être évitée par addition de RNase au lysat.