Matériels utilisés pour la DGGE

L'électrophorèse sur gel en gradient dénaturant (DGGE) est une technique de prise d'empreinte indépendante de la culture qui permet une analyse comparative rapide des modifications des communautés microbiennes. Les gènes d’ARNr 16S amplifiés à partir d’échantillons de l’environnement peuvent être séparés en fonction de leur comportement de fusion dans un gradient dénaturant de l’urée et du formamide. Une empreinte digitale de la communauté microbienne est générée, chaque bande sur le gel étant supposée correspondre à une espèce bactérienne différente. La dynamique communautaire peut ensuite être évaluée par l'analyse statistique des profils DGGE et le séquençage des bandes excisées.

Materiels

PCR

  1. ADN environnemental (Extraction d’ADN environnemental).
  2. Thermocycleur PCR.
  3. 10 x tampon de réaction ThermoPol.
  4. Mélange de solutions désoxynucléotidiques (dNTP) (5 mM).
  5. Amorces de PCR F-968-GC et 1401r (0,05 mM).
  6. ADN polymérase Taq (5 U / μl).
  7. Eau de qualité PCR.
    8. Extraction d'ADN à partir de racines et de feuilles de plantes

    DGGE

    Un certain nombre de systèmes DGGE différents sont disponibles, tels que les systèmes INGENYPhorU (Ingeny, Leiden, Pays-Bas) et DGGE-2001 (CBS Scientific, Solana Beach, Californie, États-Unis). Le protocole décrit ici l’utilisation du système DCode (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) pour la coulée de gels de 16 cm.

  8. Appareil DGGE comprenant un module de contrôle de l’électrophorèse / de la température, un réservoir d’électrophorèse et un noyau en sandwich.
  9. Ensemble de gel de 16 cm comprenant 2 plaques de verre, 2 pinces sandwich, des entretoises de 1 mm et un peigne de 16 mm de 1 mm.
  10. Matériel de moulage en gel comprenant le formateur à gradient 475, un support de moulage avec éponges, une carte d'alignement, des seringues de 30 ml, une tubulure, un raccord en Y, des raccords Luer et des verrous de seringues.
  11. Alimentation.
  12. Solution d'acrylamide à 40%: 37,5: 1 acrylamide – bis-acrylamide.
  13. Urée.
  14. Formamide désionisé.
  15. Persulfate d'ammonium (APS).
  16. N,N,N',N'-tétraméthylènediamine (TEMED).
  17. 50 × TAE: dissolvez 242 g de base Tris, 57,1 ml d'acide acétique glacial et 100 ml d'EDTA 0,5 M (pH 8) dans 1 L d'eau distillée.
  18. Colorant 2 x chargé de gel: 0,05% de bleu de bromophénol, 0,05% de xylène cyanol, 70% de glycérol.
  19. Ruban adhésif.
  20. Tissus non pelucheux.

Coloration de gel

Toutes les solutions doivent être faites avec de l’eau distillée.

  1. Solution d'éthanol à 10%.
  2. Solution d'acide nitrique à 1%.
  3. Solution à 0,2% de nitrate d'argent.
  4. Solution de révélateur: 29,2 g/L de carbonate de sodium, 0,05% de formol.
  5. 3% d'acide acétique.

Séquençage des bandes DGGE

  1. Scalpels stériles.
  2. Eau de qualité PCR.

Analyse d'image

  1. Système de capture d'image sur gel, par exemple, densitomètre GS-800 (Bio-Rad).
  2. Logiciel d'analyse d'image (Image J).

Protocoles de biologie moléculaire

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